[发明专利]一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法

摘要

本发明涉及了一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法。该方法包括陈化烟叶表面细菌富集和基因组DNA的提取两个主要步骤，通过缓冲液浸泡和梯度离心富集细菌，采用trizol试剂与试剂盒相结合的方法提取细菌基因组DNA。trizol试剂不仅能够充分裂解细菌，有效防止核酸物质降解，还能通过高速离心处理，分层后获得较纯的核酸物质，提高DNA的提取效率，再经过试剂盒的处理可有效提高基因组的获得率。本发明方法能够有效，快速的提取陈化烟叶表面细菌的基因组DNA。

主权项

一种提取陈化烟叶表面细菌基因组DNA的方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)陈化烟叶表面细菌的富集称取250g～300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入1000mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡1～2小时；用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4℃)3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000×g，4℃)15～20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物；(2)使用trizol试剂处理细菌富集物在细菌富集物中加入对应量的trizol试剂，反复吹打均匀，室温静置5min，离心(12000g，4℃)10min，吸取上部液转移至一新的离心管内；加入对应量的氯仿，轻微震荡15s，冰上静置2min；离心(12000rpm，4℃)15min，弃上层水相，将中间相转移到一个新的离心管内，加入对应量的无水乙醇，混匀静置3min，2‐8℃，不超过2000×g离心5min，沉淀DNA；移去苯酚‐乙醇上清液，沉淀既为基因组初提物；(3)使用试剂盒提取样品基因组在沉淀中加入100μL 70℃温育的缓冲液TE，涡旋震荡直至沉淀全部溶解；加入500μL试剂盒自带的调节DNA存在环境条件的缓冲液；温和翻转4～6次混合均匀；吸取混合液加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，盖上管盖，12000rpm离心30～60秒，直至全部的混合液通过吸附柱；弃滤液，将吸附柱放回收集管中，再在吸附柱中加入500μL调节DNA环境条件的缓冲液；盖上管盖，12000rpm离心30～60秒；弃滤液，将吸附柱放回一个新的2mL收集管中，在吸附柱中加入600～800μL漂洗液，盖上管盖，12000rpm离心30～60秒；弃滤液，将吸附柱放回2mL收集管中，14000rpm离心1～2分钟；弃收集管，将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入100～150μL 70℃温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000rpm离心30～60秒；弃纯化柱，‑20℃保存洗脱的DNA。