[发明专利]一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法

摘要

本发明涉及一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法，选取成熟老椰子进行处理得到脱脂椰麸粉，提取椰麸球蛋白后进行复合酶水解、离心分离制备多肽初提物，从多肽初提物中分离出5个多肽组分，收集第5个多肽组分进一步分离和纯化出12个多肽组分，将第9个组分进一步用碳18分析柱‑反相高效液相色谱分离得到2个纯肽，二者对ACE的抑制率均在70％以上。本发明以椰麸球蛋白为底物，采用复合酶解、凝胶色谱分离、反向高效液相色谱纯化等技术制备出纯度达95％以上的ACE抑制肽，既可以用于天然抗高血压药物的成分，也可以添加到食品中，进行食源性预防和治疗高血压，利于实现对椰子的综合利用和精深加工，有力促进我国椰子产业的发展。

主权项

1.一种以椰麸球蛋白为原料制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、原料前处理：选择成熟老椰子果实，然后去壳，削去种皮，清洗、刨丝、榨汁，得到椰麸；将椰麸在40～50℃干燥后粉碎，过40～60目筛，然后按质量体积比为1﹕10～1﹕20的比例加入石油醚或乙醚提取剩余的椰子油，得到脱脂椰麸粉；2)、提取球蛋白：在脱脂椰麸粉中按质量体积比为1﹕10～1﹕30的比例加入0.4～0.5mol/L的氯化钠溶液，室温下震荡提取2～3h，过滤，收集滤液；按照如上方法反复提取3次，合并收集的滤液；将滤液在4～10℃、10000～12000rpm的条件下离心15～20min，收集上清液；将上清液装入截留分子量为4000～8000透析膜中，在4～6℃的蒸馏水中透析12～24小时；透析结束后，将透析液在4～10℃、80000～12000rpm的条件下离心15～20min，收集沉淀，真空冷冻干燥后获得纯度较高的椰麸球蛋白；3)、复合酶水解制备：将椰麸球蛋白按质量体积比为1﹕15的比例溶解于0.1～0.3M磷酸缓冲液中，将pH调节至8.0～9.0，然后按质量百分比为0.5～1％的比例加入碱性蛋白酶，45～55℃下震荡水解3～6h，将水解溶液pH调节至7.0～7.5，接着按质量百分比为0.5～1％的比例加入中性蛋白酶，50～55℃下震荡水解2～4h，将水解溶液pH调节至2.0，再按质量百分比为0.3～0.6％的比例加入胃蛋白酶，37℃下震荡水解2～4h，将水解溶液pH调节至7.0，最后按质量百分比为0.3～0.6％的比例加入胰蛋白酶，37℃下震荡水解2～4h；将酶解液在95～100℃下加热5～10min，灭酶；4)、高速离心分离：将灭酶后的酶解液在4～6℃、10000～12000rpm的条件下离心25～30min，收集上清液；冷冻干燥后得到多肽初提物；5)、凝胶色谱分离：将多肽初提物进行Sephadex G‑15柱层析分离：柱长0.6～1.2米，直径为16～20mm，固定相为Sephadex G‑15，纯水洗脱，流速0.6～0.8mL/min；每5分钟收集一次，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，分离出5个多肽组分；不断重复该步骤，收集第5个多肽组分，冷冻干燥后得到该多肽组分的粉末；6)、反向高效液相色谱纯化：将上述凝胶色谱分离所得的第5个多肽组分在反向高效液相色谱上进行进一步分离和纯化：将第5个多肽组分按0.6～1mg/mL的比例溶解于蒸馏水中，过0.22微米的膜，收集滤液；将滤液进行反向高效液相色谱分离，所用分离柱为碳18半制备柱,二元梯度浓度洗脱，流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水，流速2.0～2.5mL/min，柱温30～40℃，检测波长220nm，分离出12个多肽组分；将第9个组分进一步用碳18分析柱‑反相高效液相色谱分离,二元梯度浓度洗脱，流动相A为含0.1％三氟乙酸的乙腈、流动相B为超纯水，流速0.8～1.0mL/min，柱温30～40℃，检测波长220nm，分离为2个纯肽，将2个纯肽分别收集，冷冻干燥，保存。