[发明专利]一种石刁柏全雄育种方法

摘要

本发明提供了一种石刁柏全雄育种方法，该育种方法详细步骤包括（1）花药选材与预处理；（2）配制石刁柏花药诱导培养基；（3）花药高糖处理后消毒接种；（4）花药诱导培养；（5）愈伤分化培养；（6）绿芽扩繁增殖生根；（7）炼苗与移栽；（8）染色体倍性观察，剔除非二倍体植株，辨别超雄株和雌株；（9）石刁柏超雄株和雌株的筛选与杂交。本发明的全雄育种方法通过高效花培途径获得了石刁柏花培植株，剔除非二倍体植株后获得二倍体超雄株和雌株，进而选择农艺性状优良的石刁柏超雄株和雌株，杂交获得了高产优质、长速快、抗病性强的F1代全雄系。本发明石刁柏超雄株和雌株诱导率高，杂株少，所得全雄系品质优良，产业价值极大。

主权项

一种石刁柏全雄育种方法，其特征在于：该育种方法的详细步骤如下：（1）花药选材与预处理在春季石刁柏雄株母茎抽生开花时，上午8‑10点、下午4‑5点取材，选择1.5‑2.5mm的花蕾，湿纱布包裹带回实验室，4℃低温预处理4‑5d；（2）配制石刁柏花药诱导培养基石刁柏花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl2∙6H2O 0.02～0.03mg/L，Na2MoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2‑EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，维生素C 0.35～0.45mg/L，烟酸0.45～0.55mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，谷氨酞胺0.75～0.85mg/L；激素：NAA 1.4～1.6mg/L，KT 0.75～0.85mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇13～17g/L，水解酪蛋白 0.35～0.45g/L，活性炭0.5～0.6g/L；碳源：蔗糖27～33g/L，麦芽糖13～17g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素先分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，分别加入大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，待培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.7‑5.9，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（3）花药高糖处理后消毒接种低温预处理后，将石刁柏花蕾用自来水冲洗2‑4h后，筛选花药处于单核晚期的花蕾，浸泡于1mol/L的高糖溶液中20min，转移入超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒10min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出花药，接种到步骤（2）的石刁柏花药诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基置于25‑27℃、黑暗状态培养5d后，转移到33‑35℃高温黑暗环境下热激培养5d，然后置于适温、光暗交替的环境中进行花药诱导培养，15d后开始诱导出石刁柏花药愈伤；其中适温、光暗交替的花药诱导培养环境控制为：温度26‑28℃，光照强度为800‑1200lx，光周期为24h光照/24h黑暗；（5）愈伤分化培养无菌条件下将诱导成功的直径为0.8‑2.0cm的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，置于26‑28℃、光照强度2500‑3000lx、光周期光照12h/黑暗12h环境下进行愈伤组织分化培养，17d后开始分化出石刁柏绿芽；所述分化培养基配方为：MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L+秋水仙素0.05mg/L+DMSO 0.5g/L；（6）绿芽扩繁增殖生根从培养基中挑选高度大于2.5cm的绿芽，切下转移入生根培养基，生根培养25天后，绿芽发育出白色粗壮的根；所述生根培养基配方为：1/2MS+IAA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+吡啶醇0.1mg/L+烯效唑0.1mg/L；（7）炼苗与移栽待石刁柏幼苗根长至5‑6cm后，将三角瓶封口膜打开炼苗，4～8d后将幼苗从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽到灭过菌的营养土中，放入到温室中使幼苗逐渐适应外界环境，把完全适应、生长旺盛的再生植株移栽到大田，适当遮荫，精心管理；（8）染色体倍性观察，剔除非二倍体植株，辨别超雄株和雌株采用根尖压片法观察所得石刁柏植株的倍性，剔除非二倍体植株和体细胞杂株，分辨超雄株和雌株并标识；（9）石刁柏超雄株和雌株的筛选与杂交将大田栽培的超雄株和雌株进行农艺性状筛选，选择农艺性状优良的石刁柏超雄株和雌株，杂交获得F1代全雄系；所述石刁柏的品种为美国品种阿波罗和荷兰品种硕丰。