[发明专利]一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于制备依折麦布中间体的固定化酶，其由酮基还原酶或羰基还原酶以吸附、共价结合、包埋、微囊化或交联的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，其中，所述酮基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%。本发明的固定化酶与液酶相比，降低生产成本和劳动强度，提高酶的利用效率和产品质量，减少三废排放，绿色环保。

主权项

1.一种采用固定化酶制备依折麦布中间体的方法，其特征在于：以(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基]‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮为底物，使该底物在固定化酶、辅酶、氢供体和酶活力增强剂的存在下在溶剂中发生不对称还原反应生成(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基]‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮，具体步骤为：在反应容器中加入溶剂，再依次加入底物(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基]‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮，氢供体，固定化酶、辅酶和酶活力增强剂，于温度20℃~35℃下搅拌反应，利用高效液相色谱监测反应的转化率，至转化率达到99.8%以上终止反应，反应时间6~18h，其中，所述的辅酶选自NAD或NADP，所述氢供体选自异丙醇或葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物，所述酶活力增强剂为二价金属离子，所述溶剂为pH值为6.0~7.5的水相缓冲液，反应起始时反应体系中所述(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基]‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮的浓度为8%~20%，固定化酶的浓度为5%~15%，辅酶NAD或NADP的浓度为0.005%~0.04%，所述二价金属离子的浓度为0.5~3mM，所述二价金属离子以盐酸盐、硫酸盐的形式存在，当氢供体为异丙醇时，异丙醇的体积百分浓度为8%~15%，当氢供体为葡萄糖/葡萄糖脱氢酶组合物时，葡萄糖的浓度为5%~15%，葡萄糖脱氢酶0.005%~0.03%，除二价金属离子和异丙醇外，其他所述浓度是指质量体积比浓度（w/v），单位为g/mL；所述固定化酶由酮基还原酶或羰基还原酶以共价结合的固定方式固定于固定化酶载体中制备而成，所述固定化酶载体选自环氧基固定化酶载体或氨基固定化酶载体，其中，所述酮基还原酶或羰基还原酶占所述固定化酶载体的质量百分比为0.01%~5%，所述共价结合的固定方式的步骤为：将酮基还原酶或羰基还原酶和固定化酶载体分别加入缓冲溶液中，控制固定化反应温度为15~40℃，搅拌反应8~96小时，收集固体，干燥，即得，其中，所述缓冲溶液的pH值为5~10，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、Tris‑HCL缓冲溶液或三乙醇胺缓冲溶液。