[发明专利]PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法

摘要

本发明提供PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，包括芦笋茎枯病菌原生质体的制备、原生质体的遗传转化以及遗传转化子的筛选等步骤。本发明成功实现了PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化，首次构建了一套针对该病原菌的高效遗传转化体系，获得大量能够多代稳定遗传的遗传转化子。该方法操作简单、转化周期短、可重复性强、转化效率高、稳定性好。本发明提供的方法是推动芦笋茎枯病病害分子生物学研究的重要技术创新，为该病害致病机制及抗病研究提供了一种重要手段。

主权项

PEG介导芦笋茎枯病菌原生质体的遗传转化方法，其特征在于，包括芦笋茎枯病菌原生质体的制备、原生质体的遗传转化以及遗传转化子的筛选步骤；原生质体的遗传转化方法如下：向离心管中加入0.5μg/μL质粒DNA 10‑20μL、0.6M KCl与50mM CaCl₂混合缓冲液25‑30μL、亚精胺2‑3μL，然后加入浓度为10⁷‑10⁸个/mL的芦笋茎枯病菌原生质体悬液50‑100μL，混匀后置于冰上静置10‑15min；然后加入新鲜配制的PTC缓冲液50‑100μL，混匀后置于冰上静置20‑25min；然后再加入PTC混合溶液250‑350μL，混匀后置于冰上静置10‑15min；然后加入0.6M KCl与50mM CaCl₂混合缓冲液600‑800μL终止转化反应，所得转化体系用于后续遗传转化子的筛选；其中，所述PTC缓冲液的配制如下：用水配制含有以下各组分的溶液：20‑30％PEG3350、pH7.5 8‑12mM Tris‑HCl、40‑60mM CaCl₂，55℃水浴中各组分溶解后，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌。