[发明专利]利用Pcry3Aa启动子构建高表达海藻糖合成酶工程菌的方法

摘要

本发明涉及一种利用Pcry3Aa启动子构建高表达海藻糖合成酶工程菌的方法。一种重组载体，在穿梭质粒PHT01的酶切位点BamHI上游插入通过重叠PCR将Pcry3Aa启动子片段和PhoD信号肽片段连接的Pcry3Aa‑PhoD片段，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入目的蛋白海藻糖合成酶TreS片段；本发明还涉及利用该重组载体构建高表达海藻糖合成酶工程菌的方法。本发明采用Pcry3Aa启动子自然诱导海藻糖合成酶合成，由于Pcry3Aa启动子含有STAB‑SD特殊的结构，提高了其转录mRNA的稳定性以及延长mRNA的半衰期，提高了下游目的基因mRNA的翻译水平，使得海藻糖合成酶高效表达。

主权项

1.一种利用Pcry3Aa启动子构建高表达海藻糖合成酶工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以枯草芽孢杆菌168基因组的DNA为模板，PCR扩增获得片段SpoIIID‑1；所述SpoIIID‑1基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；（2）以质粒pBRNeo为模板，PCR扩增卡那霉素抗性基因Km^r片段，制得Km^r片段；所述卡那霉素抗性基因Km^r片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；（3）通过重叠PCR扩增技术，将步骤（1）制得的片段SpoIIID‑1与步骤（2）制得的卡那霉素抗性基因Km^r片段进行重叠PCR，扩增得到SpoIIID‑1‑Km^r片段；（4）将步骤（3）制得的SpoIIID‑1‑Km^r片段经BamHI内切酶酶切后转化到枯草芽孢杆菌WB800n中，筛选有卡那霉素抗性的克隆转化子，制得sigK基因不表达的枯草芽孢杆菌WB800n [ΔSpoIIID]菌株；（5）将重组质粒Pcry3Aa‑PhoD‑PHT01‑TreS转化步骤（4）制得的重组枯草芽孢杆菌WB800n [ΔSpoIIID]菌株，筛选有氯霉素抗性的克隆转化子，制得高表达海藻糖合成酶工程菌WB800n [ΔSpoIIID]+[Pcry3Aa‑PhoD‑PHT01‑TreS]菌株；所述重组质粒Pcry3Aa‑PhoD‑PHT01‑TreS为在穿梭质粒PHT01的酶切位点BamHI上游插入通过重叠PCR得到的将Pcry3Aa启动子片段和PhoD信号肽片段连接的Pcry3Aa‑PhoD片段，在BamHI和AatII两个酶切位点之间插入目的蛋白海藻糖合成酶TreS片段；所述的Pcry3Aa启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； PhoD信号肽片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；海藻糖合成酶TreS片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。