[发明专利]一种抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库及其构建方法和用途

摘要

本发明公开了一种抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库及其构建方法和用途，本发明从猪瘟C株弱毒疫苗免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离到的淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到抗猪瘟病毒VHH抗体的cDNA片段，将VHH抗体的cDNA片段与pGADT7‑Rec共转化酵母感受态细胞，得到抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库。对所构建的酵母cDNA文库的容量及多态性进行了鉴定，结果表明该文库的滴度约为5.5×106cfu/ml，且多样性好，文库的重组率为100％。采用血凝抑制试验对抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库进行初步功能性鉴定，表明所构建的酵母文库中存在具有中和活性的抗猪瘟病毒VHH抗体。本发明的提出为筛选抗猪瘟病毒VHH抗体提供了平台，并且为猪瘟的早期治疗和诊断提供了新的技术手段。

主权项

一种抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)淋巴细胞分离从猪瘟C株弱毒疫苗免疫的骆驼的抗凝血中分离得到淋巴细胞，保存备用；(2)淋巴细胞总mRNA的提取提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；(3)全基因cDNA合成以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；(4)第一轮扩增以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1为引物进行第一轮扩增，扩增程序为：95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min，将扩增产物电泳，纯化收集600bp产物，‑20℃保存备用；P1:5‑GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG‑3R1:5‑GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC‑3(5)第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，以P2、R2为引物进行第一轮扩增，扩增程序为：95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min；扩增产物电泳，纯化收集400bp产物，置‑20℃保存备用；P2:5‑TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGGAGTCTGGGGGAGG‑3R2:5‑GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT‑3(6)文库的构建和收获制备酵母感受态细胞，每600uL感受态细胞转化20ul第二轮扩增产物和6ul pGADT7‑Rec载体，将转化的菌液均匀涂布于SD/‑Leu平板上，30℃倒置培养3‑5d直至克隆出现；再次将平板置于4℃冰箱，放置3‑4h，给每块平板加入含25％(v/v)甘油的YPDA液体培养基，并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液，即得抗猪瘟病毒VHH抗体的酵母cDNA文库。