[发明专利]南芥菜花叶病毒核酸探针杂交快速检测方法

摘要

本发明公开了一种南芥菜花叶病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于包括：A、百合总RNA的提取；B、RNA检测；C、RT‑PCR扩增步骤；D、RT反转录；E、PCR扩增；扩增所用引物包括：上游引物ArMV‑11：5’‑CCAGTGCCTACAAGAGTGTGTC‑3’；下游引物ArMV‑22：5’‑TGA(G)GCAAAAGGATTG(A)TCTCCAAGG‑3’；电泳分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，南芥菜花叶病毒核酸探针杂交快速检测方法。

主权项

一种南芥菜花叶病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于包括：A、总RNA的提取：取1克百合样品于研钵中，加入液氮，迅速研成均匀的粉末；将粉末全部移至冰上预冷的离心管，向离心管中加入4ml异硫氰酸胍溶液，轻轻摇晃离心管使混合均匀；按顺序加入2M pH4.0的NaAc 400ul，pH4.5的水饱和酚2ml、氯仿/异戊醇＝49：1的混合液2ml,轻轻摇晃均匀，最后将离心管颠倒几次混合均匀；冰浴15min；4℃离心，13000rpm 20min；将上清转移至另一离心管中；然后加入等体积预冷的异丙醇，混匀后‑20℃沉淀2小时；4℃，13000rpm离心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul异硫氰酸胍溶液中，再加600ul异丙醇，混匀‑20℃沉淀1小时；4℃，13000rpm 20min；弃上清，沉淀用70％预冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于80‑120ul DEPC处理过的双蒸水中，检测后分装，‑70℃保存；B、RNA检测：4ul RNA+1ml ddw装入石英杯，测260nm和280nm OD值RNA的含量是:OD×10ug/ul260/280≥2则RNA纯，如果<1.6则有杂质，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。C、RT‑PCR扩增步骤：RT‑PCR检测步骤：由于这个病毒的基因组是RNA，所以要采用RT‑PCR方法进行检测：D、RT反转录：在0.5ml灭菌离心管中加入：总RNA         1μgOligo dT 6    0.5μg灭菌双蒸水至  11ul混匀后置于70℃5分钟然后在冰上冷却后再加入：37℃孵育5分钟加入40u M‑‑MuLV37℃孵育60分钟，70℃10分钟终止反应并置于4℃备用；E、PCR扩增：在0.5ml无菌薄壁离心管中加入：其中上游引物ArMV‑11：5’‑CCAGTGCCTACAAGAGTGTGTC‑3’下游引物ArMV‑22：5’‑TGA(G)GCAAAAGGATTG(A)TCTCCAAGG‑3’充分混匀后离心10sec,反应条件：94℃预变性3min,冷却至延伸温度72℃时加入2.5u Taq酶，然后按照94℃1min,退火温度47℃或52℃1min,72℃2min,循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存反应产物，以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，其中LSV的退火温度：47℃；ArMV的退火温度：52℃反应完毕后，取2ul反应液在0.8％agrose胶上电泳分析。