[发明专利]一种适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法

摘要

本发明公开了一种用流式细胞术进行小麦根尖细胞的G1期，S期，G2/M期分析的方法，属于生物技术领域。该方法包括小麦种子浸种催芽，切取小麦根尖样品，样品经卡诺氏固定液固定；磷酸缓冲液漂洗干净；置于纤维素酶和果胶酶混合酶液中酶解1‑2 h；漂洗干净后通过研磨制成单细胞悬液；漂洗后用DAPI染液对根尖细胞避光染色10 min；漂洗过滤后通过流式细胞仪将不同DNA含量的周期时相，包括G1期，S期，G2/M期细胞进行区分和计数，了解细胞的增殖情况。该方法具有简单易于操作，分离材料易于得到，酶解方法简单，获得单细胞悬液纯度高，流式细胞仪检测效果好，结果稳定。

主权项

一种适用流式细胞术进行小麦根尖细胞周期分析的方法，它是利用固定好的小麦根尖样品，制备小麦根尖组织的单细胞悬浮液，进行荧光染色，流式细胞仪检测，包括：（1）小麦种子进行浸种催芽，待根长长至3‑5 cm时，切取约0.2 cm长度的根尖，固定于新鲜配制的卡诺氏固定液中30 min，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗干净后再转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；所述的卡诺氏固定液指的是：甲醇:冰乙酸的体积比为3:l；其特征在于：（2）将固定好的根尖样品置入0.1－0.2％（v/v）的甘油中渗透2‑3h，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，静置沉淀后用移液枪吸取上层缓冲液，再浸没于纤维素酶和果胶酶制成的混合酶液中，37 ℃酶解1.5‑3 h，使小麦根尖组织松软；所述的纤维素酶和果胶酶的质量浓度皆为2%，用去离子水配制；（3）将所述步骤2）中的小麦根尖用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，用移液枪吸取大部分上层缓冲液后，用研棒温和研磨成单细胞悬液，过滤，收集滤液，即可获得单细胞悬液；（4）单细胞悬液经3000 r.p.m.离心4 min，获取的沉淀加入浓度为0.5‑2 μg/ml 的4，6‑联脒‑2‑苯基吲哚染液，摇匀后避光染色10 min，细胞内DNA物质被荧光染色，用pH 7‑8的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min；（5）染色后单细胞悬液用流式细胞仪进行检测，激发光波长为340 nm。