[发明专利]肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法

摘要

本发明提供一种肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法，属于生化检验技术领域，该方法包括：（一）标本染色步骤：（二）标本染色后化学法检测步骤：a.石蜡切片脱腊及水化；b.抗原修复；c.清除内源性过氧化物酶活性；d.封闭；e.一抗孵育；f.二抗孵育；g.加入辣根酶标记链霉卵白素液，孵育30分钟；PBS洗涤洗5min×3次；h.DAB显色；i.细胞核复染；j.封片。该肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法有利于探讨STC患者肠黏膜BDNF的表达改变及与排便障碍的相关性，并观察STC患者肠黏膜神经纤维密度和超微结构的异常。

主权项

1.肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法，其特征在于该方法包括：（一）标本染色步骤：（1）脱蜡与水化：肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本干燥后的切片用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水；（2）苏木精液染色60s；（3）流水洗去苏木精液10s；（4）1%盐酸乙醇洗3s ；（5）水洗2s；（6）促蓝液返蓝洗10s；（7）流水冲洗30s；（8）伊红染色60s；（9）蒸馏水洗2s；（10）80%乙醇洗2s；（11）95%乙醇洗2s；（12）无水乙醇洗2s；（13）石炭酸二甲苯洗3s；（14）二甲苯洗3s；（15）二甲苯洗3s；（16）中性树胶封固，封片时每片载玻片滴加1～2滴明胶，将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡；（二）标本染色后化学法检测步骤：a.石蜡切片脱腊及水化a1.脱蜡：将染色后切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各放置15min进行完全脱腊；a2.水化：切片放入100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各10min后，于95%酒精水化5min→90% 酒精水化5min→80%酒精水化5min→70%酒精水化5min→蒸馏水浸洗10min；b.抗原修复:将a步骤切片插入250 ml、浓度为0.01mol/L、pH值为6.0的柠檬酸钠抗原修复液中，用微波高档加温缓冲至96℃15 min，注意避免煮沸，取出后自然冷却至室温后蒸馏水洗；c.清除内源性过氧化物酶活性：用0.3% H₂O₂甲醇溶液孵育20分钟，放入60%酒精5min，放入蒸馏水5min，PBS缓冲液洗5min；d.封闭：用于二抗来源动物相同的正常山羊血清封闭60分钟；e.一抗孵育：加入兔抗人PDG9.5抗体，300倍稀释，阴性对照滴加PBS，4℃孵育过夜；f.二抗孵育：加二抗前用PBS对切片漂洗三次，每次5min，把未结合的一抗完全洗掉；加入生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，二抗按1:2000稀释，室温孵育30分钟，后用PBS洗涤5min×3次；g.加入辣根酶标记链霉卵白素液，孵育30分钟；PBS洗涤洗5min×3次；h.DAB显色：先以少量PBS或Tris‑HCl缓冲液溶解DAB，然后再加入余量缓冲液，在显色前加入30% H₂O₂，将洗涤后的切片浸入显色液中5‑10‑20min，闭光下反应，并随时在显微镜下观察结果，阳性反应部分为棕色时终止反应，在自来水洗涤切片10min；i.细胞核复染：将切片放入苏木素中做核复染20s～1min，经酒精‑HCl分化后，放入自来水中继续分化细胞核；j.封片：经70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100% Ⅱ酒精脱水各2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别透明5min后，用树胶封片。