[发明专利]一种大菱鲆弧菌的LAMP检测方法

摘要

本发明公开了一种大菱鲆弧菌的LAMP检测方法。根据大菱鲆弧菌luxR基因设计两对引物FIP，BIP，F3，B3，配制含两对引物的LAMP反应体系，对LAMP扩增产物加入SYBR Green I进行检测。本发明比现有PCR技术检测大菱鲆弧菌的方法有更高的特异性、灵敏度、快速、便捷，并且可以用于现场的快速检测，有利于及时发现鱼类中大菱鲆弧菌的传染和爆发。

主权项

大菱鲆弧菌LAMP检测方法，其特征在于包括下述步骤(1)根据大菱鲆弧菌LuxR基因，设计并合成以下两组单独使用的引物组合：引物组合一：FIP引物：5’‑ACTTCATCACGGGTTGACGCG‑CGCTGAAGATTGTCATTGGC‑3’BIP引物：5’‑AGCACCAACCGAACTAACCAGT‑CGTTACACACTTCGCCGC‑3’F3引物：5’‑ACCTCGCGAATTTGACATCA‑3’B3引物：5’‑CGTTGCAAGATCAGCAGGAT‑3’；引物组合二：FIP引物：5’‑CCAATGACAATCTTCAGCGATGAG‑CAAACAAAACCTCGCGAATT‑3’BIP引物：5’‑TAAAGTGTGGTTTGAGTGGAGC‑ACTGGTTAGTTCGGTTGGT‑3’F3引物：5’‑TCGACCTAGATTTACACGC‑3’B3引物：5’‑TCCATCGCTTTGATAAACATG‑3’；(2)配制LAMP反应体系反应体系的终浓度为：外引物F3和B3各5pmol/μl,内引物FIP和BIP各20pmol/μl，dNTP 0.25mM,Tris‑Cl 20mM,KCl 10mM,(NH₄)₂SO₄ 10mM,MgSO₄ 2mM，0.1％Triton X‑100,8U Bst DNA聚合酶和1μl DNA模板，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl；(3)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58℃到65℃，反应时间为30min到90min；(4)扩增产物检测：取扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳；或将产物加入SYBR Green I，观察反应管中颜色变化。