[发明专利]特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法

摘要

本发明涉及特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，属于植物基因工程领域。利用发根农杆菌介导将烟草根特异启动子NTR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS载体pBI121‑NTR2‑AhRESS遗传转化花生，获得特异表达AhRESS的转基因花生发状根。利用有机溶剂浸提法提取转基因花生发状根中白藜芦醇，经高效液相色谱（HPLC）测定，其白藜芦醇含量最高为66.16μg/g（FW），是未转基因发状根中白藜芦醇含量的3倍。本发明为利用烟草根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在花生发状根中特异表达，进而生产白藜芦醇提供了良好的基础。

主权项

1.特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121‑NtR2‑AhRESS经发根农杆菌介导转化花生；（2）转pBI121‑NtR2‑AhRESS花生发状根液体悬浮培养；（3）转pBI121‑NtR2‑AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测；步骤（1）的具体方法为：1）将烟草根特异启动子NtR2连接至pMD18‑T 载体中，得到pMD18‑NtR2载体；2）pBI121‑NtR2‑GUSA载体构建：利用限制性内切酶BamHⅠ及SacⅠ对pBI121质粒载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从pCAMBIA1301载体中克隆GUSA基因，连接至酶切后的pBI121载体上，得到pBI121‑GUSA载体；将pBI121‑GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18‑NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接至pBI121‑GUSA载体中，得到pBI121‑NtR2‑GUSA载体；3）pBI121‑NtR2‑AhRESS载体的构建：将花生白藜芦醇合酶基因AhRESS基因，连接到pBI121‑NtR2‑GUSA载体中，得到pBI121‑NtR2‑AhRESS载体；所述步骤（1）中烟草根特异启动子NtR2的序列为SEQ ID No：1，花生白藜芦醇合酶基因AhRESS的序列为SEQ ID No：2；所述步骤（1）中发根农杆菌介导的花生的遗传转化外植体分别为叶片、子叶、上胚轴和下胚轴外植体；所述步骤（2）中转pBI121‑NtR2‑AhRESS花生发状根液体悬浮培养所用培养基为MS培养基+500 mg/L Cef，第一次继代培养基为MS培养基+300 mg/L Cef，第二次继代培养基为MS培养基+100 mg/L Cef，第三次继代培养基为MS培养基；三次继代后Cef浓度降至0；所述步骤（3）中转pBI121‑NtR2‑AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测方法为HPLC，色谱条件为：色谱柱 ODS，流动相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱温25℃，进样量10 μL。