[发明专利]用于鉴定广金钱草类型的引物组、试剂盒以及鉴定广金钱草类型的方法

摘要

本发明提出了用于鉴定广金钱草类型的引物组、用于鉴定广金钱草类型的试剂盒、以及鉴定广金钱草类型的方法。用于鉴定广金钱草类型的引物组由下列构成第一引物至第七引物，其中，所述第一引物至第七引物分别具有SEQ ID NO1～7所示的核苷酸序列。本发明用于鉴定广金钱草类型的引物具有下列优点的至少之一通用性强、利用该引物鉴定广金钱草类型的准确性高、客观性强以及稳定性高。

主权项

一种鉴定广金钱草类型的方法，其特征在于，包括：(3‑1)广金钱草植物基因组DNA的提取：采集到的新鲜广金钱草叶片经变色硅胶吸水干燥后用无水乙醇洗净叶片表面，待无水乙醇挥干后用剪刀剪成细小的碎片，加入液氮后迅速用球磨仪研磨成粉末；将磨好的叶片粉末迅速加入到800μL预热到65℃的DNA提取缓冲液中65℃水浴25分钟，每5分钟将EP管颠倒数次，防止叶片粉末结块，取出EP管，置于冰上，加入等体积的Tris‑饱和酚：氯仿：异戊醇，充分摇匀后放入离心机，20℃下10000rpm离心10min，取600μL上清液，向上清液中加入等体积氯仿：异戊醇，摇匀后放入离心机中，20℃下10000rpm离心10min，取上清液400μL于灭菌后的EP管中，此上清液为未纯化的DNA溶液；选用天根新型植物基因组提取试剂盒对提取的基因组DNA进行纯化，向未纯化的DNA溶液中加入700μL缓冲液GP2，充分混匀，将混匀的液体转入吸附柱CB3中，10000rpm离心30s，弃掉废液，向吸附柱CB3中加入500μL的缓冲液GD，放置10min，10000rpm离心30s，弃掉废液，向CB3中加入600μL漂洗液PW，10000rpm离心30s，倒掉废液，向CB3中加入90％乙醇，10000rpm离心30s，倒掉废液，将CB3置于室温放置15min，挥干乙醇，将CB3放入灭菌后的EP管中，加入100μL的TE缓冲液，室温放置5分钟，10000rpm离心2min，将离心得到的溶液再加入到吸附柱CB3中，室温放置3min，10000rpm离心2min，得到纯化后的广金钱草DNA；(3‑2)ISSR‑PCR反应体系的优化及其稳定性分析：(3‑2‑1)ISSR‑PCR扩增程序的建立：以哥伦比亚大学大学公布的60个ISSR通用引物为基础，用NEW ENGLAND BIOLABS Tm Calculator引物退火温度在线计算器以及Primer Premier 5引物设计软件对其退火温度进行计算，Tm值均在50℃附近，初步程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性45s；50℃退火40s；72℃延伸60s；循环40次；72℃延伸10min；4℃保存；(3‑2‑2)ISSR‑PCR反应工作液的浓度：各反应底物浓度如下：底物浓度10×Taq buffer‑Mg2+‑dNTPmixture2.5mM引物10mM模板DNA～100ng/uL甲酰胺‑ddH2O‑(3‑3)ISSR‑PCR扩增及其产物分析：(3‑3‑1)ISSR‑PCR扩增：在表5所列出的ISSR‑PCR反应体系及表6所列出的退火温度的条件下，对15分核酸样品进行ISSR‑PCR扩增反应，经扩增反应后，取PCR反应产物7μL与3μL核酸染料工作液混合，在1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，电压为110V/cm，电泳时间为90min，以100‑II bpDNA Marker为PCR产物片段的长度标尺，电泳完成后，将胶块放在紫外分析仪上拍照并记录，根据产物进行凝胶电泳后的结果显示，UBC890、UBC836两条引物扩增出的产物特异性较差，对15份核酸样品的区分能力小，而UBC808、UBC809、UBC842、UBC844、UBC845、UBC855、UBC888共7条引物对样品模板DNA扩增效果较好，优选扩增较好的7条引物扩增出的条带作为后续聚类分析的对象，表5 ISSR‑PCR反应体系反应底物加入体积(μL)ddH2O11.0甲酰胺0.510×Taq buffer2.0Mg2+2.0模板DNA1.0dNTP mixture1.5Primer1.0Taq酶1.0表6 ISSR‑PCR中引物退火温度的设置(3‑3‑2)聚类分析：从电泳图可以看出，7条引物共扩增出67条条带，其中多态性条带共计51条，多态性比率达76.1％，每条引物可扩增出5～11条特异性条带，平均每条引物可扩增出7.29条条带，扩增产物在相同迁移位置有带计为1，无条带计为0，构建0‑1原始数据矩阵，用SPSS进行聚类分析，并建立聚类树，并对聚类结果进行分析。