[发明专利]利用SOD酶鉴定紫花苜蓿耐热性的方法

摘要

本发明公开了利用SOD酶鉴定紫花苜蓿耐热性的方法，它涉及植物耐热性鉴定技术领域，它的鉴定步骤为：(1)、植物材料和高温胁迫处理；(2)、SOD活性测定和同工酶电泳及染色；(3)、RNA的提取与反转录；(4)、引物序列；(5)、数据统计分析。它于人工气候箱内，模拟自然生境，在35℃/30℃(昼温/夜温)条件下，对土培紫花苜蓿成苗进行长期高温胁迫。通过测定SOD酶活性、同工酶谱和SOD酶的mRNA转录水平来鉴定紫花苜蓿的耐热性，鉴定需要的时间短，结果可靠。

主权项

利用SOD酶鉴定紫花苜蓿耐热性的方法，其特征在于：它的鉴定步骤为：(1)、植物材料和高温胁迫处理供试紫花苜蓿品种为‘德钦’，‘阿尔冈金’（‘Algonguin’ ，FDR=2，百绿公司提供）和‘赛迪10’（‘Sardi 10’，FDR=9，百绿公司提供）；设25℃/20℃（昼温/夜温）为对照（即高温胁迫0d），采用35天持续长期高温胁迫（35℃/30℃，昼温/夜温）的方法进行处理，处理后第7d，14d，21d，28d和35d取完全张开和相同部位的叶片进行分析；(2)、SOD活性测定和同工酶电泳及染色称取新鲜叶片0.25g，酶液的提取参照赵雁等的方法， SOD活性测定参照Giannopolitis和Ries氮蓝四唑比色法，稍有改动；采用Laemmli（1970）不连续非变性聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳法进行电泳，采用Beauchamp和Fridovich的方法进行SOD活性染色，每个样品重复电泳和染色6次；(3)、RNA的提取与反转录称取高温胁迫0d和35d的新鲜叶片各100mg，液氮研磨后采用总RNA提取试剂盒（SGTriEx，SinoGene）进行，以1μg RNA、1μL MgCl2反应缓冲液、1μL DNase I、RNase‑free water溶解处理，鉴定gDNA以及RNA的纯度；反转录引物使用Oligo（dT）18，反应60min后得到mRNA的反转录产物，‑80℃保存；qRT‑PCR分析，使用20uL反应体系（2×SG Green qPCR Mix 10μL、10μM Forward Primer 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、ROX 0.4μL、cDNA 1μL、Water, nuclease‑free 7.8μL）；反应程序设置：预变性（95℃ 10 min）；变性（95℃ 15s）、退火（55℃ 15s）、延伸（72℃ 45s），45个循环；脱离（95℃ 15s、60℃ 30s、96℃ 15s），持续读取荧光信号获得溶解曲线；(4)、引物序列根据NCBI公布的基因序列和RNA序列，设计内参ACTIN 和SOD引物，交由Sinogenesci公司合成；(5)、数据统计分析同工酶迁移率的计算，迁移率=酶带迁移距离／溴酚蓝迁移距离；Cyt Cu/Zn SOD、Chl Cu/Zn SOD、Fe SOD和Mn SOD mRNA的转录量按照2‑ΔΔCt方法计算；重复所得数据用Excel分析和做图、用SPSS进行多重比较、用Photoshop对电泳图片进行编辑。