[发明专利]安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法

摘要

本发明公开了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)选择对照动物模型；(2)样品采集；(3)耳组织DNA提取；(4)PCR扩增TLR4目的片段；(5)SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有效遗传标记，为安徽地方猪种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。

主权项

1.一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外来猪种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；(3)耳样组织DNA提取；(4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序，与NCBI登录号为AY753179比对，存在如下突变：C318A、G417A和C1027A；(7)针对步骤(6)中所述C318A、G417A和C1027A进行群体遗传学特性分析；(8)仔猪血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性；根据TLR4基因单核苷酸多态性SNP与免疫指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选有效标记位点；所述步骤(4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤(3)获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank猪TLR4基因外显子3序列，其登录号为AY753179，采用Primer Premier5.0软件设计2对引物，进行TLR4基因外显子3部分序列的克隆，并采用2％琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TLR4 exon3‑1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，引物TLR4 exon3‑2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，退火温度及目的片段长度见表1；表1 猪TLR4基因引物序列所述步骤(8)中仔猪血清免疫指标的测定过程为：35日龄断奶仔猪空腹前腔静脉采血，常规分离血清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm处测质量浓度分别为1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml共7个浓度的标准品的吸光度，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度；进而依照相对应的标准品的标准曲线，依次计算血清中IL‑6、IL‑10、IL‑12、IFN‑γ、TNF‑α的浓度。