[发明专利]一种切除筛选标签的方法与应用

摘要

本发明公开了一种切除筛选标签的方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明是以染色体上整合了两侧带有同向loxP序列的pyrG筛选标签的重组菌为出发菌，利用位点特异性重组系统切除位于两个loxP序列之间的pyrG筛选标签使菌株能再次作为出发菌使用pyrG筛选标签进行遗传转化。利用本发明的方法可以进行筛选标签的切除，使筛选标签可循环利用，遗传改造不再受筛选标签不足所限制，为多基因、多位点的遗传改造提供支持。

主权项

一种切除筛选标签的方法，其特征在于，是以染色体上整合了pyrG筛选标签的重组菌为出发菌，利用位点特异性重组系统切除pyrG筛选标签使菌株能再次作为出发菌使用pyrG筛选标签进行遗传转化；所述出发菌，为土曲霉（Aspergillus terreus）；所述染色体上整合了pyrG筛选标签的重组菌，pyrG筛选标签的两侧还整合了同向loxP序列；所述pyrG筛选标签源于曲霉，在两侧带有同向的loxP序列；所述位点特异性重组系统，为Cre/loxP位点特异性重组系统；所述切除pyrG筛选标签，是切除两侧带有同向loxP序列的筛选标签pyrG；所述Cre/loxP位点特异性重组系统，Cre重组酶的用量为2‑9U；所述方法，步骤如下：上述步骤具体如下：1)分别敲除土曲霉CICC40205的ku80基因和pyrG基因，构建尿嘧啶营养缺陷型重组菌At‑∆ku80‑∆pyrG；2)以黑曲霉Co827的pyrG基因表达元件pyrG1为筛选标签，并通过分子克隆的方法在两侧加上同向的loxP序列，获得两端带有同向loxP位点的pyrG1筛选标记loxP‑pyrG1‑loxP，以步骤1）所构建的尿嘧啶营养缺陷型重组菌At‑∆ku80‑∆pyrG为受体菌，以loxP‑pyrG1‑loxP为筛选标签进行回补实验，获得整合有loxP‑pyrG1‑loxP筛选标签的重组菌At‑∆ku80‑pyrG1‑loxP；3)制备步骤2）所得重组菌At‑∆ku80‑pyrG1‑loxP的原生质体，以DNA为辅助载体向原生质体细胞中导入2‑9U的Cre重组酶进行筛选标签切除，通过筛选尿嘧啶营养缺陷型的方式筛选pyrG1筛选标记被切除的重组菌。