[发明专利]透明质酸的制备方法

摘要

本发明涉及一种透明质酸的制备方法，其解决了现有方法产率不高的技术问题，其包括以下步骤：种子培养；菌体发酵；蛋白酶诱导表达；生物转化。本发明还提供了其专用培养基。本发明可广泛用于透明质酸的制备领域。

主权项

1.一种透明质酸的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）种子培养：将工程菌E.colipBPAB/BW25113接种到LB培养基，培养温度35-40℃，培养时间3-6 h，转速200-300 r/min，当菌体生长至对数生长期时进行转接；（2）菌体发酵：将种子液转接到发酵培养基中，培养温度30-37℃，转速200-300 r/min，菌体密度至0.6-1.5 OD时，进行蛋白酶诱导；（3）蛋白酶诱导表达：添加0.1-2 g/L诱导物L-阿拉伯糖，同时降低诱导温度至27-35℃，转速200-300r/min，培养16-20 h，得到转化菌体，并离心收集菌体；（4）生物转化：用转化培养基重悬菌体至10-40 OD，转化温度30-37℃，转速200-300 r/min，用氨水每隔2-5 h调节pH值至7.0-9.0，转化16-24 h，得含有透明质酸的转化液；所述发酵培养基的组成成分为：酪蛋白1-10g/L；酵母粉1-5 g/L；甘油1-8 g/L；NaCl 5-10 g/L；无机氮源30-70 mM；所述转化培养基的组成成分为：葡萄糖30-60 g/L；N-乙酰葡萄糖胺20-45 g/L；硫酸铵3-5 g/L；正十二烷2-7%；硫酸镁1-4 mM；氯化锰1-2 mM；磷酸氢二钾15-20 g/L；磷酸二氢钾1-5g/L；所述工程菌E.coli pBPAB/BW25113的构建方法包括如下步骤：（一）含多杀巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的共表达载体pBPAB的构建以多杀巴氏杆菌CVCC 408的基因组DNA为模版，PCR扩增PmhasA和PmhasB基因，用NcoⅠ和BamHⅠ对透明质酸合成酶基因PmhasA的扩增产物进行双酶切，用BamHⅠ和SacⅠ对UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的扩增产物进行双酶切，用NcoⅠ和SacⅠ对载体pBAD-HisB进行双酶切；使用PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段；采用T4连接酶将上述3个片段连接；转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆提质粒，重组载体记作pBPAB；（二）重组菌的构建pBPAB/BW25113菌液的获得：从大肠杆菌BW25113平板上挑选单克隆接种到LB培养基中，培养，将测序鉴定正确的质粒pBPAB加入到上述感受态细胞中，培养，挑选单克隆，培养，所得为pBPAB/BW25113的菌液。/n