[发明专利]一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法

摘要

本发明公开了一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法。本发明通过转基因技术，获得了带有n-3 FatI基因的转基因波尔山羊成纤维细胞，脂肪酸测定分析表明：该转基因细胞能将n-6多不饱和脂肪酸转化为n-3多不饱和脂肪酸。通过对该转基因细胞和转pEGFP-N1细胞进行细胞增殖、细胞凋亡和细胞衰老方面的比较分析，得出结论：FatI基因在该山羊转基因细胞中具有抗衰老作用。本研究为制备带有n-3 FatI基因的畜禽动物，获得自身合成n-3多不饱和脂肪酸的畜禽，进而高效、低廉地生产出含有n-3多不饱和脂肪酸的蛋奶肉制品提供了不可缺少的条件。

主权项

一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据GenBank中的的线虫序列，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的FatI基因的编码区序列，并在起始密码子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了HindIII，KpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；S2、将步骤S1合成的序列连接到克隆载体pUC57载体中，获得重组质粒pUC57‑FatI，将pUC57‑FatI和真核表达载体pCDNA3.1(+)用限制性内切酶HindIII，KpnI进行双酶切，胶回收相应的片段，将FatI基因连接入将连接入真核表达载体pCDNA3.1(+)中获得重组质粒pCDNA3.1(+)‑FatI；将经过质粒抽提获得的pCDNA3.1(+)‑FatI用SalI酶切后胶回收相对大的片段，以备转染；S3、取怀孕35天的波尔山羊，手术迅速取出山羊胎儿，用含双抗的PBS冲洗2遍，在超净工作台上将山羊胎儿去头去尾去内脏，剩下的部分用剪刀剪碎后加胰酶消化30min，用移液器吹打至大部分为单个细胞，将所得的细胞置于添加有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/L硫酸链霉素的DMEM/F12培养基上，5％CO2培养箱中37℃培养；S4、当步骤S3中细胞汇合度达到85％左右时，用胰酶消化收集步骤S3所得的细胞，并用PBS冲洗2次，以彻底去掉胰酶，用无抗生素的细胞培养基稀释细胞，加入经过酶切回收的带有FatI基因的DNA，混合后冰浴10min，用电穿孔仪ECM830进行电转染；取出电击杯，冰浴10min后，将细胞转移至培养皿中在37℃，5％CO2环境的培养箱中培养；细胞培养至24小时后加G418，进行抗性筛选；S5、经过11天的培养筛选，培养皿中开始出现阳性克隆，将阳性克隆挑出后培养于96孔板中，然后逐级放大到24孔板和6孔板中，得到促使细胞内n‑6脂肪酸向n‑3脂肪酸转化的稳定表达FatI基因序列的细胞株；S6、基因组PCR初步检测阳性细胞：对步骤S5培养过程中留在原培养板上的细胞继续培养，待细胞铺满培养板时用胰酶消化收集细胞，用基因组抽提试剂盒提取细胞的基因组，PCR初步检测外源基因是否进入细胞；S7、FatI的mRNA水平表达检测：基因组PCR检测为阳性的一个细胞株，利用EASYspinRNA快速抽提试剂盒进行RNA的提取，反转录后进行定量PCR检测细胞株中FatI的mRNA表达水平；S8、脂肪酸组成分析：转Fat I基因及pEGFP‑N1质粒的波尔山羊成纤维细胞克隆放大到10cm细胞培养皿上后，添加10μmol/L的亚油酸和花生四烯酸进行培养，细胞完全长满后，用胰酶消化收集细胞；细胞用去离子水洗涤，加入2.5％H2SO4/甲醇溶液1mL，80℃加热90min，冷却到室温后加入1.5mL 0.9％NaCl溶液和1mL正己烷，震动、低速离心将脂肪酸提取到有机相；吸取上层清液经液氮吹干后用于气相色谱(GC_MS)分析；S9、进行BrdU标记和检测：在细胞培养过程中加入10mM BrdU标记12小时后，用70％的乙醇固定，然后用PBS将残余的乙醇清洗干净，加入鼠源抗BrdU的抗体作为一抗，二抗用Cy3标记的抗鼠的IGg，奥林巴斯BX51荧光显微镜下拍照；S10、TUNEL法检测细胞凋亡：在4℃条件下，用4％的多聚甲醛固定细胞25分钟后，加入荧光素标记的dUTP和末端转移酶37℃孵育一小时，然后分别用柠檬酸钠和PBS淋洗细胞，Hoechst 333258用来特异于细胞核着色，在荧光显微镜下能发绿色荧光细胞即为凋亡细胞，随机选取三板，每板上随机选择一个区域的至少1000个细胞进行计数，用凋亡细胞数除以细胞总数即为细胞凋亡率；S11、细胞衰老检测：将细胞培养于24孔板，用PBS淋洗后，加入β‑半乳糖苷酶试剂，室温孵育15分钟，PBS淋洗后加入1mL染色试剂，37℃孵育过夜，显微镜下拍照；S12、进行数据统计。