[发明专利]精确验证未知基因甲基化程度的方法

摘要

本发明涉及一种精确验证未知基因甲基化程度的方法，最新精确验证未知基因甲基化程度的方法，通过分别对实验组和对照组目标基因进行特异性引物设定，利用高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelting，HRM）的差异定性，其产物通过添加转化剂，DNA外切酶酶解，利用LC-MS/MS对其中胞嘧啶（或腺嘌呤）含量百分比进行精确定量,通过上述两步实验得到的定性及定量数据，总结细胞或组织分化中癌变几率和甲基化程度的关系，以便建立关联数据库，从而在癌症的超早期诊断中发挥作用的新方法。

主权项

一种精确验证未知基因甲基化程度的方法，其特征是该方法包括如下步骤：a）DNA模板制备及引物设计：进行DNA提取，所提取的DNA作为模板，采用化学诱变法处理DNA模板，通过对某一或者多个待测片段目的基因进行引物设计；待测基因内部或全部的核酸序列扩增长度应在100~300bp间；b）熔解曲线定性及PCR产物酶切：按照HRM仪器设定参数完成高分辨率熔解曲线数据采集，并根据Tm值变化情况，初步排除未突变样本；进行PCR产物纯化；利用1μg/mL DNA模板进行DNA标准曲线制备；利用荧光定量PCR，测定PCR产物浓度；用去离子ddH₂O将待测所有PCR产物和同步配制的QC样品进行稀释至统一浓度，用DNA外切酶进行最优酶切条件孵育;c）酶切后单核苷酸片段回收及质谱鉴定：将酶切后待测产物用液液萃取法纯化，方法是将其转移至96孔板，加入150uL乙腈沉淀蛋白，3700rpm离心20min后，上清液转移至96孔进样板，并用去离子ddH₂O进行1:1稀释，振荡器上混匀1分钟后待质谱进样检测，分别监测胞嘧啶（C）浓度减少量和腺嘌呤（A）的增量，变化量记为δCon.C，试验分六个平行对照，计算δCon.C，并给出RE及RSD值，QC样品的胞嘧啶（C）浓度不能高于或低于理论浓度的10%。