[发明专利]一种新型调节性树突状细胞的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种新型调节性树突状细胞的制备方法及联合DC‑CIK进行肿瘤免疫治疗方法。经分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；在适合细胞生长和增值的条件下，共同培养步骤中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。其特征在于，所述新型调节性树突状细胞在CpGODN(CpG寡核苷酸)或具有同样诱导功能的诱导剂的诱导下转化为成熟调节性树突状细胞，其中irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能。所述新型调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长，并能够联合DC‑CIK进行肿瘤免疫治疗。

主权项

1.一种调节性树突状细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(2)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤(1)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；共培养的方法如下：1)共培养的时机，在共培养前12h先以2×10⁴/ml的细胞浓度，将常规方法获得的第3代间充质干细胞接种于加入24孔板培养，以使其贴壁，12h后加入分离纯化的CD34+造血干祖细胞进行共培养；2)两种细胞数目比：间充质干细胞与造血干祖细胞之比为1∶5～1∶10；3)共培养条件：含100U/ml链霉素，100U/ml青霉素的RPMI‑1640完全培养基，5％CO₂，37℃恒温培养；培养过程中，为防止间充质干细胞分化及凋亡，每3‑4天用新的间充质干细胞置换，具体方法为：先吸出悬浮细胞，置于离心管内；用0.125％胰蛋白酶+0.01％EDTA消化贴在间充质干细胞上的细胞；用Ficoll去除死细胞和间充质干细胞；将获得的细胞和悬浮细胞混合，洗涤后计数，并加入贴有新间充质干细胞的24孔板继续培养；4)共同培养7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的调节性树突状细胞；所述步骤4)中回收得到的调节性树突状细胞是irf4+irf8+的不成熟调节性树突状细胞；所述调节性树突状细胞在CpG ODN的诱导下转化为成熟调节性树突状细胞，其中irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能；调节性树突状细胞的诱导成熟方法为：共培养获得的regDC以每孔5‑10×10⁴个细胞浓度接种于96孔板中，用含CpG ODN 10μg/ml孵育6h的X‑VIVO‑15无血清培养基继续培养3天，收获悬浮细胞后即成熟regDC；经CpG ODN诱导成熟的调节性树突状细胞能够促进T细胞及NK细胞增殖；经CpG ODN诱导成熟的调节性树突状细胞能够能促进T细胞及NK细胞分泌IFN‑γ；经CpG ODN诱导成熟的调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长。