[发明专利]一种利用重组菌株转化制备4-羟基-L-异亮氨酸的方法

摘要

一种利用重组菌株转化制备4‑羟基‑L‑异亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过筛选获得了一株有异亮氨酸双加氧酶活性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373，克隆了其异亮氨酸双加氧酶基因ido，然后构建带有目的基因的重组菌株，通过重组菌催化转化底物L‑异亮氨酸得到4‑羟基‑L‑异亮氨酸。本发明得到了双加氧酶基因，且为4‑羟基‑L‑异亮氨酸的获得提供了有效途径，对于今后生物催化剂的开发具有较为重要的意义。

主权项

一种利用重组菌株转化制备4‑羟基‑L‑异亮氨酸的方法，其特征在于步骤为：（1）基因ido的获得：以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS‑1为出发菌株提取基因组，所述BS‑1为保藏号CCTCC NO：M 2013373的枯草芽孢杆菌；根据相关基因的同源性设计了以下简并引物：含有NcoI 限制性酶切位点的引物1：5'‑CATGCCATGG AAATGARTGG STTTAGCA‑3'，其中R=A/G，S=C/G；含有SalI 限制性酶切位点的引物2：5'‑ACGCGTCGAC TTTTGTCTCC TTATAAGAAA ATGT‑3'；PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1为1 μL，50 pmol/μL的引物2为1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的 Taq DNA polymerase 0.5 μL；PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min；用PCR纯化试剂盒纯化DNA片段；将外源基因与质粒pMD19‑T连接，反应体系组成如下：质粒pMD19‑T 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合连接液，将其置于16℃下连接4h；连接后的产物转化至E. coli JM109感受态细胞中，得到阳性质粒pMD19‑T‑ido，基因测序；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CCTCC NO：M 2013373 L‑异亮氨酸双加氧酶基因ido，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2；根据测序结果，设计以下表达引物：含有NcoI 限制性酶切位点的引物3：5'‑CATGCCATGG AAATGAAAAT GAGTGG‑3'，含有SalI 限制性酶切位点引物4：5'‑ACGCGTCGAC TTATTTTGTC TCCTTATAAG‑3'；利用质粒提取试剂盒从克隆大肠杆菌中提取质粒pMD19‑T‑ido；PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1为1 μL，50 pmol/μL的引物2为1 μL，pMD19‑T‑ido 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL；PCR反应过程如下：95℃预变性5 min；95℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸10 min；用PCR纯化试剂盒Bioer Technology Co. Ltd纯化目的基因ido片段，保藏备用；（2）重组质粒的构建：利用限制性内切酶NcoI 和SalI对扩增得到的ido基因与载体pET28a进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a‑ido；（3）重组菌株的构建：重组质粒pET28a‑ido转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，通过含有50μg/mL的卡纳抗生素的LB平板筛选目的重组菌株E. coli BL21(DE3) ( pET28a‑ido)；（4）4‑羟基‑L‑异亮氨酸的制备：利用重组菌株E. coli BL21(DE3) ( pET28a‑ido)，经过菌体的培养，以L‑异亮氨酸为底物，进行微生物细胞的催化转化反应：2mL 50 mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，pH 6.0~9.0中，菌体细胞浓度为20%~50%，底物浓度为10~50 mmol/L，α‑酮戊二酸的浓度为10~50 mmol/L，FeSO₄·7H₂O的浓度为0.5~2 mmol/L，抗坏血酸的浓度为5~20 mmol/L，反应温度28℃，反应时间10‑24h；反应完成后混合物离心取上清液，即得4‑羟基‑L‑异亮氨酸。