[发明专利]基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法

摘要

本发明涉及一种基于多肽两端非等重稳定同位素标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。以胞内蛋白酶赖氨酸‑C对变性还原烷基化后的蛋白质进行酶切，形成含有N端α‑氨基和C端赖氨酸侧链ε‑氨基的肽段。样品分成两份后，使用含有不同同位素的标记试剂对多肽N端α‑氨基进行选择性衍生；再使用含有不同同位素的标记试剂对多肽C端赖氨酸ε‑氨基进行衍生或者在培养细胞时，使用含有同位素标记赖氨酸的培养液来实现对蛋白质中赖氨酸的标记。最后，将样品混合，使用高效液相色谱‑质谱进行分离和鉴定。本发明通过标记形成成对存在的多肽碎片离子而加以分辨，降低干扰信号的影响，提高碎片离子选择特异性和多肽测序准确度；提高从头测序的速度。

主权项

基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法，其特征在于：对蛋白质进行变性后，对其中含有的二硫键进行还原，然后用烷基化试剂封闭自由巯基；对处理后的蛋白质采用胞内蛋白酶赖氨酸‑C进行酶切；酶切后形成的多肽，使用化学/代谢标记的方法对多肽N端的α‑氨基和C端赖氨酸侧链氨基分别进行标记；在进行标记时，将样品分成等量的两份，分别使用含有不同同位素的轻重标记试剂进行标记，使一份样品中的多肽N端采用轻标记试剂进行标记、多肽C端采用重标记试剂进行标记，使另一份样品中的多肽N端采用重标记试剂进行标记、多肽C端采用轻标记试剂进行标记，且使得二份样品间轻重标记的相同肽段的分子量相差不超过2Da；将标记后的二份样品混合，使用一维或者二维液相色谱‑质谱联用进行分离和鉴定；在质谱鉴定时，将分离窗口设置为2‑8Da，使得不同标记的多肽同时碎裂；根据同位素标记引起的多肽碎片离子质量差异鉴别N端b离子，C端y离子，进行蛋白质氨基酸序列从头测序分析。