[发明专利]一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法

摘要

本发明提供了一种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT-PCR特异性引物，是对GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但相互之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV-1的特异性检测引物SEQ1、SEQ2，一条Taqman探针Probe1；一对针对DHAV-3的特异性检测引物SEQ3、SEQ4，一条Taqman探针Probe2；确定了针对DHAV-1和DHAV-3的双重荧光定量RT-PCR的特异性引物及Taqman探针浓度；利用该组引物建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法，特异性好、灵敏度高，可以用于1型和3型鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定和实时定量分析。

主权项

一种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT‑PCR特异性引物，其特征在于是对GenBank上已发表的DHAV‑1、DHAV‑3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但相互之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV‑1的特异性检测引物SEQ1和SEQ2，一条Taqman探针Probe1；一对针对DHAV‑3的特异性检测引物SEQ3和SEQ4，一条Taqman探针Probe2，引物序列如下：SEQ1：5’‑AGACACATGTTGCTGAAAAACT‑3’，SEQ2：5’‑AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC‑3’，SEQ3：5’‑CTTGAACGTAATAGAGCTTGG‑3’，SEQ4：5’‑AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC‑3’，Probe1:5’CY5‑ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC‑3’BHQ2,Probe2：5’FAM‑ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC‑3’TAMRA，所有引物以无菌ddH₂O配成10pmol/μl的浓度备用；上述引物、探针的使用方法为：A、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应；反应体系为：模板RNA4μl，SEQ2/SEQ4引物各0.5μl，5×M‑MLV Buffer2μl，浓度为10.0mM的dNTPs2μl，Rnase Inhibition0.25μl，浓度为5U/μl的RTase M‑MLV0.5μl，ddH2O0.75μl；反应程序为：42℃反应50min，70℃15min，获得病毒cDNA；B、以病毒cDNA为模板进行荧光定量RT‑PCR反应；反应体系为：3.45μL ddH₂O，12.5μL Premix Ex Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4各1μl，ROX Reference Dye II0.25μl,Probe10.5μl和Probe20.3μl，2μl cDNA模板；PCR反应条件为：95℃5min；95℃15s，60℃45s，40个循环；于60℃时收集荧光；C、用标准曲线计算出测得Ct值所对应的样品浓度：反应最终输出的Ct值可用标准曲线换算出对应的样品浓度，纵坐标为所得Ct值，横坐标为样品浓度的对数值。