[发明专利]一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：采用特异性引物和试剂盒进行PCR扩增；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断气溶胶样本中是否含有布鲁氏杆菌。本发明还公开了特异性引物(如SEQIDNO.3～9所示)以及试剂盒(由特异性引物、pEASY-T3-VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成)。本发明的方法既可用于养殖场气溶胶中布鲁氏杆菌的检测与鉴定，也可用于临床血液、血清、奶样、组织等样本的检测与鉴定。

主权项

一种检测及鉴别诊断气溶胶中布鲁氏杆菌的方法，其特征在于：步骤如下：(1)采集气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：所述试剂盒由特异性引物、pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；所述pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒是由序列为SEQIDNO.10所示的DNA片段与pEASY‑T3载体相连接后得到的重组质粒；所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对；所述通用型检测引物对的序列如下：VirB10‑2‑F：5′‑TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG‑3′；VirB10‑2‑R：5′‑TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC‑3′；所述布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对的序列具体如下：牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Abortus‑F：5′‑GCGGCTTTTCTATCACGGTATTC‑3′；Abortus‑R：5′‑GACCGCATTCATGGGTTTCG‑3′；羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Melitensis‑F：5′‑AACAAGCGGCACCCCTAAAA‑3′；Melitensis‑R：5′‑CATGCGCTATGATCTGGTTACG‑3′；猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对：Suis‑F：5′‑CATGCGCTATGATCTGGTTACG‑3′；Suis‑R：5′‑ACCGGAACATGCAAATGAC‑3′；(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立pEASY‑T3‑VirB10阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有布鲁氏杆菌；当所用特异性引物为布鲁氏杆菌牛种、羊种和猪种鉴别检测引物对时，若对应于牛种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛种布鲁氏杆菌；若对应于羊种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有羊种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有羊种布鲁氏杆菌；若对应于猪种布鲁氏杆菌特异性检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有猪种布鲁氏杆菌；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有猪种布鲁氏杆菌。