[发明专利]兰科植物授粉成功与否的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA；双酶切和连接；预扩增和选择性扩增；聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；获得授粉后差异甲基化差异片段；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；将获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。

主权项

一种兰科植物授粉成功与否的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)提取兰科植物被测植株授粉前后各时期的基因组DNA，稀释后作为反应模板；(2)双酶切和连接：用识别四碱基的Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ同裂酶分别与识别六碱基的核酸内切酶EcoR Ⅰ组合对步骤(1)得到的反应模板DNA进行双酶切和连接；(3)预扩增和选择性扩增：将步骤(2)所得的连接产物应用AFLP技术进行预扩增和选择性扩增；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染：选择性扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和银染后获得所需条带；(5)获得授粉后差异甲基化差异片段：比较授粉前后EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双泳道的带型，重点分析授粉后植株中有带而未授粉子房中无甲基化差异带的情形；从聚丙烯酰胺胶上挖取授粉后子房特异差异甲基化片段；(6)将步骤(5)获得的授粉后差异甲基化差异片段进行回收、克隆及测序；(7)选择与授粉后子房发育有密切关系的片段作为分子标记,按照标记成探针后，分别与授粉后各时期植株基因组DNA进行Southern杂交，若杂交结果成阳性，则被测植株授粉成功，确定子房启动发育时间，若杂交结果成阴性，则被测植株授粉未成功，确定子房未启动发育时间。