[发明专利]一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其分离培养方法如下将鹅颈动脉放血处死，取出卵巢，用磷酸盐缓冲液冲去血污；剥净卵泡外层结缔组织和血管网；在卵泡柄的对面无血管区切开，稍微用力挤出卵黄，分离颗粒细胞；胶原蛋白酶水浴消化；加入胎牛血清终止消化；过滤，获得颗粒细胞悬液；反复离心洗涤，收集细胞沉淀于含3%胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基；接种到细胞培养皿中，培养，使之贴壁，获得鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞。本发明公布了一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养的方法，采用本方案可以很好的将颗粒细胞分离，且能获得较纯的颗粒细胞，具有切实可行，可操作性强，稳定可靠，重复性好等优点。

主权项

一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞培养的方法，其特征在于，其操作步骤为：(1)将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢卵泡，再用PBS冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500mL烧杯中，迅速转移至细胞培养室中；(2)将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500mL烧杯中洗净血污后，置于含有PBS的培养皿中；(3)将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄成分，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中；(4)将初次分离的颗粒细胞置于37℃预热的PBS培养皿中清洗5次，洗净卵黄；(5)将清洗后的颗粒细胞置于50mL的小烧杯中并加入2mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织，机械分离持续5min，再将其封口后，置于37℃水浴消化4min；(6)向消化完全的颗粒细胞中加入适量胎牛血清，终止消化；(7)将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50mL的离心管中封口1000rpm离心10min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次；(8)加入含有胎牛血清的DMEM培养液吹打细胞使细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×106个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2mL；(9)用75％的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37℃，5％的CO2；上述步骤中所述PBS缓冲液是：在500mL去离子水中依次加入8g的NaCl，0.2g的KCl，1.56g的Na2HPO4·2H2O，0.2g的KH2PO4，溶解后用1mol/L的NaOH调节PH值至7.2～7.4，用去离子水定容至1L，121℃，100kpa灭菌30min；上述步骤中所述的含有胎牛血清的DMEM培养液是含3％胎牛血清的DMEM；上述步骤中所述的胶原蛋白酶是100mg的胶原蛋白酶稀释于100mL的水中，其终浓度为1mg/mL。