[发明专利]用于水稻的基于毛细管电泳和SSR荧光标记的遗传分析方法

摘要

本发明提供了一种用于水稻的遗传分析方法，该方法应用毛细管凝胶电泳对SSR-PCR扩增产物进行检测，利用毛细管凝胶电泳技术的高分辨率特性，区分出遗传关系相近的水稻品种，使得分析结果更加准确。采用本发明的毛细管凝胶电泳－SSR标记的遗传分析方法，经UPGMA聚类分析所建立的树状图可用于水稻品种的遗传关系分析，具有分辨率高、快捷高效、结果准确可靠等优点，且该方法易于自动化，便于大量数据的整合与分析，这是传统的检测方法所不能比拟的。

主权项

 用于水稻的基于毛细管电泳和SSR荧光标记的遗传分析方法，分辨出水稻各品种的特异性DNA片段，建立扩增片段的分布图，用NTSYSpc软件按照UPGMA进行聚类分析，得到供试水稻材料的树状图，可用于水稻资源亲缘关系的分析；其特征是：实验步骤：（1）水稻基因组DNA的提取取水稻嫩叶于液氮研磨成粉末状，加入1.2 ml 65℃预热的SDS提取液，摇匀，65℃水浴45 min；加入200 μl KAc，混匀后，冰浴15 min；4℃ 10000 rpm离心15 min，取1 ml上清液，加入等体积氯仿混匀；4℃ 12000 rpm 离心7 min，取上清液，加1/10体积的NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，冰浴20 min；4℃，10000 rpm 离心10 min，弃上清，用70%酒精洗涤2次，晾干沉淀；加入200 μl pH8.0已灭菌的TE溶液，溶解沉淀，即得DNA 溶液，置于‑20℃保存备用；（2）引物的筛选与合成筛选出9对SSR引物对研究材料全基因组进行遗传多样分析，将筛选出的引物正向序列5'端以“CY5”磷荧光染料标记，合成荧光引物，并避光保存；（3）PCR扩增反应20 µl反应体系包含：12.8 µl ddH₂O，10×PCR Buffer2.0 µl，dNTP2.0 µl，Primer F1.0 µl，Primer R1.0 µl，rTaq polymerase0.2 µl，DNA1.0 µl；反应条件：94℃预变性4 min，40个循环，每个循环94℃ 1 min、55℃ 45 sec、72℃ 45 sec，最后72℃延伸10 min；（4）毛细管凝胶电泳检测①调整遗传分析仪BECKMAN COULTER CEQ 8000系统：安装毛细管和凝胶，将毛细管温度调整至50℃，按照0.4 ml凝胶，重复3次模式进行初级管路冲洗，执行毛细管充胶，重复3次，执行光路聚集，监控仪器基线，使系统背景值低于6000RFU；②输入样品信息：输入待测样品名，选择电泳分离方法和数据分析方法，保存样本信息；③样品分析：使用去离子水冲洗水槽三次，加入去离子水至标线，擦干水槽外表面，装入水槽，放入上样板和缓冲液板，开始运行样本；④数据分析：PCR产物与Genescan‑400分子量标准品的荧光信号均由遗传分析仪自动保存；用GeneMapper‑V3.0软件对遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同参试材料的SSR标记的扩增片段，利用软件将SSR标记片段与Genescan‑400分子量标准品比较，得到SSR标记片段长度大小；（5）遗传多样性的数据统计与分析每对SSR引物检测到1个位点，视每条多态性带为1个等位基因；将观测到的每条带视为一个性状，有带时赋值为“1”，无带时赋值为“0”，建立数据库；所获得的0/1数据用NTSYSpc 2.10软件进行聚类分析，选用相似性SM系数，以SHAN Clustering进行UPGMA聚类分析。