[发明专利]沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法

摘要

本发明涉及一种沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，该方法利用齿肋赤藓转录组数据库，选取15个内参候选基因，以15个内参基因为模板设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物，选取受10种非生物胁迫和没有胁迫（对照）的齿肋赤藓配子体为实验材料进行荧光定量PCR实验，运用geNorm，NormFinder和Refinder软件进行荧光定量数据的分析，从而筛选出齿肋赤藓开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合，最稳定的内参分子是CDPK和α-TUB2。用本发明所述方法可避免不同非生物胁迫下的齿肋赤藓配子体材料在RNA质量，产量及反转录效率等上的存在的误差，能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化，提高了该种基因定量研究的准确性和可靠性。

主权项

一种沙漠藓类齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行：a、利用齿肋赤藓转录组测序数据，挑选15个齿肋赤藓内参候选基因，并以挑选的15个齿肋赤藓序列为基础设计了15对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为：序列1齿肋赤藓SyntrichiacaninervisActin核苷酸序列ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACAGAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGGCGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGAGGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACCGGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCATTCTGCGGCTGGACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGGCCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACACAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGCGGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTACAACTCGATCATGAAGTGTGACGTCGATATCCGTAAAGACCTGTACGGAAACATCGTGTTGTCTGGAGGATCGACCATGTTCCCGGGCATCGCCGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCGCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCGCCGCCGGAGAGGAAGTACAGTGTCTGGATCGGAGGATCCATCTTGGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTGCGAAGAGCGAGTACGATGAGTCCGGTCCATCGATTGTGCACAGGAAGTGCTTT实时荧光定量PCR引物序列：正向引物：TCGTGTTGTCTGGAGGATCG反向引物：TACTCGCTCTTCGCAATCCA序列2齿肋赤藓Syntrichiacaninervis肌动蛋白相关蛋白核苷酸序列GTGAGCCATGAGTTGAAACTAATAAATTGGAAAGAAAAACAAGCTCAGAAAATGAGCGTACATCGTTGAGACGGTCAGACGAACCATTATCTACGGACATGCGTATTGCGTTGTTCAGGAATGTTCTTTGCGTGGAACTCGGTGTCGGTAACTGGAAGATGTTGACGCAGTTGCTGCTGTTACCTTGCTGACCAAGTTTAGTCCAACATGGCATTGTACCAAAAAGCTTGCGCCTGGAGGGTGTTGGAGTCCCTGTACTTTCGGCCGCTGCCCACCATGACCATACCGTCCAACCAGTCCTCGTACTGCACCCATGAGTCGCGTCCGAAGTCCAAGACGGCGAGAACCGCGCCACCTTTCCACATGATATTCATTGGAGCCATTCGATTTTGAAGAACCTCCACAGTGTCCACAGCTTCGTCCACAGGTATGGCGTGCAGAACCCTCTCCTCAACAGCATCAACCAGGCCTTTCGTTAACCCAACGCCGCCAACCAGCTGAATACTCGCGAACAGCTTCTTCTGAAGATCCACGCGACCTAACGACAGGATACTTTTCACAATAGCTTGTGCAAGGCCACTTGAAGCTTCTTCCACCTCTTTCTTCCCTTTATCTTCAAAGTCGTACGGATCGGAATCATTGTTAATAGAGTTTCCATTAACACTTCCGTTGGTTCCTCCTGTTTCATTTGTCTCAATACGTCGGACAGCTTCAGAAAATGAATCTTCCGCAGTATCTTCATAATCTACGTGATACCAGGGTCGAGGAAGAATCGAATACTCTTCCAGTGCAAGTAGCGAAGGGTAAAATAGTCCCATGGGTGGAATGTTGATGGAAGATAATACGACTGTATATACTCGAGTTGGCTCGCCTGCCATGCGGCACTTGATATCAACCGTCGTGTGTTGCTCACCTTCCAGAAGCACGCAGTGGGTCTCCTTCAGTTTCTCAAGAGTCAAAAAGTCCAACGGATCACGCAAAGGATCAGTATCAGCCAGGGGCCATGTCTTCTTTCGTTGTTGGACCCATAACAAACACCTAGTGATGTCATCTCCACCATACGGCAGCAGAAAACGTGTTGATGGAATAGCAACCCCTTCCTCAACACACATGCCTGAGATAACTTGTGCACCCATGTTTACGATACATCCAGATGAAAAGCCATTCCCAAATGTAGCCGCAACGCATTCCTGGA实时荧光定量PCR引物序列：正向引物：GCAAGTAGCGAAGGGTAAA反向引物：TGCCGTATGGTGGAGATG序列3齿肋赤藓Syntrichiacaninervis转录延伸因子核苷酸序列TTGAAGGTCTTTCTGATATAATCTTCCTTCTTTAAGCGAGTCTTTTCCTGCTCGTTGAGTAAGAAGGTGATGTCGGATTTAAAACGCTTGTCCCGGTGCTGCGTATCATCCCTAGACTCTTCCCGCATATCGCTTTCCTTGCATGTCAAATCGACCAAGTACTTATCCTTTTTCACCTCTTTCACTCGGCAAGTCACTGAAGTGCCTTCTGAAAATTTATCTTTAAGTTCAACATCGCCGTCATCTGAAACATCTTCCTTCTGAATGAAACCCAGTAATCCACATTCCAATACACACATGAGCTGATGTTCCTGCACTCTTCTTATTGTTGCTTGTACAATTCCACCTTCAAAGAGTGTCTCTTTGCTCTCCCCGGTCATGAGATAGAAACACTCTTCTTGAGACGGCTCCGAGTACGACCTCCGCCATTCTTGAAATCCTCGCTGCAGCTCAGATTTGATCAACTCCAGTGTCTTCAATCCCCGGCCTTCAACGTGTGCAGATTGGGCATACTCCGCAATGTCTACAGAATCTAAAGCGTTGGGATTTTTAATCACACGATCTACTGCCATACTTGGCACATCATCGTCCACTTCTTCGTTATTCCGCATGCCTTCCTTCTCGATCGCAGCTTCAGCTAGGTTCTTTGCCATCTGATACAACTCAGGGTGAATACGGGTGTTGTCTAAAAGCTCTGTAGGACGTAAATCTGAAGGTGTTTCTCCAATTTCACGCACTCGGATGAAACCAGCGGAATTTGTGAAGACTTTCTCATTCACAGCCCGTATGGTCGAGTAAAGACTATCTCGAGTCAATACACGCTTTACCACTTGAAGATTTGTCCGAAACTCACAAGCCTTCAGAGGGCCAAGACCCGCAACGAACTGAAGGGTCTCAAACAACCAGTCGTGGATAATAGCTAGA实时荧光定量PCR引物序列：正向引物：ACTTGGCACATCATCGTCC反向引物：ATTCCGCTGGTTTCATCC序列4齿肋赤藓Syntrichiacaninervis钙依赖型蛋白激酶核苷酸序列TGAGATGTTTAAACACTACCTCAATTACATGCTGAAATCCAATACATTTGACGTAGAAGCATCAACAGTGTTTGGCACCTAATCATTTCCTCTCGGGCGCCTCTAGCGATGGCACTGAAAATGATACACGGGGACTAAAGGCCATGGCCCTAGAGCAAGTAACATGACAAACTTTACATATTCAAACTCCCCATGGTAAGGAGAGAGTGCTACTCGCCTCTGTAGAAGTGACTGGTTCGCACAGCCATGTTGAGGTGCCTACTTCCTGCTGAACTCGGTGTGAACCCTATCCTCCGATCCCCAACGCGTCGGTCAGATTCAACTGCTGGCTGTTGCGTAGCGATGAGCGACCAGCACCGCCCTTGTTGCCCTTGCGCATCATGTTGACGAACTCGGTGTAATCAATCTGGCCATCGTTGTTCTGGTCGACCTCCCTGAGCAGCTCCTCCACGGATACGTCTCCCATGTTGAATTCGGCCAACGCATGTTGCAGCTCATCGACCGTCAGATAGCCGCTGTTGTCCTTGTCTAGGTACGAGAAGGCGGCGAACATGTTCTCATCGCGTTCGACCTTGTTCAGGTGGAGAGTGGCGGCCAGAAACTCGCCATAATCGATTGCCCCACTGCCGTCGACGTCAGCGGCGTCCATGAGCTGCCGAACGTCTTCCTCTTTGAGATTGGAACCCACTTTCTTCAGACCCGCCTTCAGCTCCTCGTAGCTGATGGACCCTGAGTTGTCCGTGTCCATCATCTTGAACATCTCCTTCAGACCTGCGATCTCCTCCTCCGACAAGGACTCCGCGATCACCCGGATGGCGATCTTCTTCAGCTTGTTCATTGCGGAGAAGTGCTTGAGCCGGGATTGCACTGCGGAATCGATGGGTCTGTCGGGCGCTACTCCGTCCTCGCAGATCCAAGGATGTGCCAACACTTGATGGGCTTTCAACCTCTTCGAAGCCTGGGGCGTGAGCATTTTGCGGATCAAATCCTTGGCGCTATCAGAAATCTTAGGCCATGGATCTGATGCAAAATCAAGCTCTGATTTCAAAACCTGCTCAAAGATGCCCTGCTCCGTCTCTGCCCAGAATGGAGGGACTCCGCTGAGAAGGATGTAAAGTATCACACCCGCACTCCACACATCCGCTTCCGGGCCATAGTTCTTCCTCAACACTTCAGGTGCCACATAGTAAGGGCTTCCAACCACATCTCTGAAAACTTCTCCAGGTTTAAAGAACACTGATAGCCCAAAATCAGTCGT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苷酸序列ATTCGTCTTTTTGTTTGGTTGCGTAAGTGTTTAGGTTGACACAATCCTCGTTTCGCTTCTAGGTTTTGTGTTTTGGCGTTTAAATCACTGAGGTTTCCCTGAAGACCTTTGATGCCATAGAGATGACGCTTTCCTTGTCCTGCTTACAGCTTGAGCTGGTGTGACAGTATCCGAATTTGCCCTAATTGGAGGGGCATGTGAAGCTCACGATCTGGGTCCGCTTACAAGCTCACAGCTTTAGTCAGTATTGACAACATGGGATGATCGTCTTGCAATCTCGAAGAAGCGATGGAGCAAGACGGATTGGATTCATGGAGCAGGCTACCGGAAGATGTCGTGCTGAGAGTGCTCACGCGCCTGCCAATTCCGCATCTTTTCCGCGCGCGCACGGTCTGCAAGCAATGGAATGCGCTCACTTCGACCCCGGAGTTTCTGGCCATGTGCAGCGCGCGTCACGCGCCCTACTTCCCGGTGGTGATCTCGCGCCGCTTCTACATGGGCGACCTGGGGATCTGCTTCCTGGGGAACGACTCGCAGGGCGGCAACGACCTCTTCCGCGTCTTCTTCGGCTACGACCATGAGGCGCAAGCGTGGCAGAAGCTGCCCCCGTTCGACTTCCTCCCGCACGAGGCGCGCATCCCGGTGGCCTCCGCCGGCGGCCTCATCTGCTTCCGCGGCACCTCCAGGCTCTTCCTGTGCAACCCCGTCGCCCGGAGCTTCCTGGAGCTCCCCGCCATCACGTACAAGTGGCCGCCGTCCGTCTCCGTGCACATCCTCGTGGAGAGCAGCGCCTTCAAAGTCATCATCGTGGGGAAGATCCGCCACAACTTCGTCACCGACTCCTTCCGCAGCATCGCCATCTACGAGTCCGTCACCAAGGCCTGGCGCGTCGTGGACGCGCCGCATCCCGCGAAGGTATTCTCCTACGGTCCCACTGCAGCCGTCTGCGGCAACTCCATCTACTGTGAGGCGATTTGCCATTGCGGCCAGCTGGGTGTGATGGCCTACGACGTCCAGTCCGAGACGTGGAACCCGGTGTTGCATGAGATTCCGAGTGATGAACGCGGCGAGTATCAGCTGACGCAAGTTGTG实时荧光定量PCR引物序列：正向引物：CGCCTTCAAAGTCATCATCG反向引物：GGCAAATCGCCTCACAGTAG序列15齿肋赤藓Syntrichia caninervis18s核糖体RNA核苷酸序列TTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTTTGAGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGTCGGCCGGTCCGCCTCTGGTGTGCACCGGTCGTCTCGTCCCTTCTGCCGGCGATACGCTCCTGGTCTTAACTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCGCTGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGGATACATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCA实时荧光定量PCR引物序列：正向引物：GGAGAGGGAGCCTGAGA反向引物：CACCAGACTTGCCCTCCAA；b、分别选取干旱，高盐，冷，热，干热混合，脱落酸，氧化，机械损伤，重金属，紫外胁迫共10种非生物胁迫及无胁迫处理，总共11齿肋赤藓配子体样本为实验材料，进行荧光定量PCR模板实验；c、将实时荧光定量PCR得到的数据导入两个最常用的内参稳定性评价软件geNorm，NormFinder和一个内参稳定性综合评价软件Refinder进行内参稳定性和内参数目分析,筛选出最优内参分子和内参分子组合。