[发明专利]原癌基因HRAS启动子甲基化模式与膀胱癌的临床相关性研究方法

摘要

本发明涉及一种原癌基因HRAS启动子甲基化模式与膀胱癌的临床相关性研究方法，其具体过程为：(1)获得组织标本；(2)筛选转录因子结合位点和CpG岛：确定了-412to-91bp共322bp的序列进行亚硫酸氢盐测序扩增，共含28个CpG位点；(3)基因组DNA的提取和基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰：修饰过的DNA悬浮于20ul去离子水中立即使用或-80度存储；(4)亚硫酸氢盐测序(BSP)的PCR和DNA测序；(5)统计分析。本发明研究发现，HRAS基因的异常甲基化可能是膀胱肿瘤发生是一个早期事件，并可以进一步被用来作为癌症生物标志在膀胱癌的早期诊断和早期治疗中发挥重要作用。

主权项

一种原癌基因HRAS启动子甲基化模式与膀胱癌的临床相关性研究方法，其特征在于：具体过程为：(1)获得组织标本：所有组织标本来自第三军医大学大坪医院，通过外科手术从患者体内获得组织样品，样品经过病理分析最终确定的15人为膀胱癌患者的组织标本，5人通过病理学分析后证实为非癌变的组织作为正常对照，所有癌组织标本均为确定为移行细胞癌和WHOII级(中度分化的)，被切除后的肿瘤标本和正常对照组织样品预先放在液氮中，并对患者的临床特征进行了记录，包括性别，发病年龄，临床分期，淋巴结转移和组织学分级的等；(2)筛选转录因子结合位点和CpG岛：HRASTRRCpG岛通过在线工具(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html)分析，采用默认设置(window：100；step：l；observedtoexpectedratioofCplusG：0.6；minimumaveragepercentageofGplusC：50；minimumlengthofreportedCpGisland：200bp)分析，并在线设计引物(http：//www.urogene.org/methprimer/indexl.html)使用默认设置(window：100；shift：1；Obx/Exp：0.6；GC％：50％)；转录因子预测通过在线工具(http：//www.cbrc.jp/htbin/NPH‑TFSEARCH)进行证实，最终确定了‑412to‑91bp共322bp的序列进行亚硫酸氢盐测序扩增，共含28个CpG位点；(3)基因组DNA的提取和基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰：基因组DNA使用微量DNA抽提试剂盒抽提，按照说明书所介绍步骤进行，用蛋白酶K消化后，从组织裂解释放的核酸被吸附在硅胶柱上，并利用高速离心机将裂解物通过吸附柱，5～8个洗涤周期后，DNA被溶解到洗脱液中，并收集在一个干净的1.5ml收集管中；分离的DNA用亚硫酸氢钠修饰，所用试剂盒为修DNA甲基化修饰试剂盒；简要的操作步骤如下，lugDNA用NaOH变性，在55度条件下，用亚硫酸氢钠处理8小时，修饰过的DNA悬浮于20ul去离子水中立即使用或‑80度存储；(4)亚硫酸氢盐测序(BSP)的PCR和DNA测序：通过PCR扩增重亚硫酸盐处理的DNA，反应用特异性引物如下：HRASF：5‑AGTTTTTTGTGGTTGAAAGATG‑3；HRASR：5‑CAACCCTCAAAAACAAAACTAA‑3；PCR条件如下：94℃变性5分钟，35个循环的95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，72℃延伸5分钟；将PCR产物通过电泳在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分离，然后利用凝胶回收试剂盒进行回收；纯化的PCR产物，连接到PMD19‑T载体；通过氨苄青霉素筛选后再进行PCR验证；随机挑选8个阳性克隆进行DNA测序；(5)统计分析：甲基化的比例用甲基化的CpG数除以总的CpG数获得，差异性分析采用非配对t检验分析。