[发明专利]一种马铃薯病毒的快速灵敏检测方法

摘要

本发明公开了一种云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种病毒的检测方法。本发明通过对云南马铃薯主栽品种丽薯6号、云薯401、宣薯2号病株中马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯A病毒和马铃薯卷叶病毒4种特异性混合抗体诱捕病样中病毒，不必提取样品总RNA进行随机引物逆转录和特异性病毒引物复合PCR反应。本方法将快速、特异的免疫沉淀与灵敏的复合RT-PCR结合，同时设置健康马铃薯随机引物cDNA产物和相应病毒PCR特异片段阳性质粒作为阴、阳性对照，从而快速、准确、灵敏的应用于检测田间马铃薯植株样品、抗病毒材料及田间环境疑似侵染源等方面。

主权项

一种马铃薯病毒快速灵敏检测方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括：A、前处理：待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心取上清液备用；根据GenBank序列数据库中马铃薯病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对的相互影响，筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50μl加入PCR管中，36~38℃放置0.5~1.5h以捕捉（或沉淀）对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤1~2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3~5℃放置待用；B、PCR反应：在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用马铃薯病毒引物对进行复合PCR反应；C、电泳检测：取PCR反应液5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。