[发明专利]一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用

摘要

本发明公开了一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法及其在临床上治疗感染性外伤的应用，所述蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，步骤为含IsCT目的片段的获得；多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建；毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建；重组毕赤酵母的构建和筛选；重组菌的摇瓶发酵诱导表达。本发明综合多项因素，采用巴斯德毕赤酵母表达系统，选用分泌型表达载体pPICZαA和Mut+型宿主菌X‑33，进行分泌表达蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并对体外分泌表达产物进行抑菌活性检测，为其在临床上治疗外伤类感染类疾病提供理论基础及技术支持。

主权项

一种蝎源抗菌肽IsCT在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)含IsCT目的片段的获得以α信号肽为模板设计引物，上游引物：5′GCGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC 3′，下游引物：5′CCGGAATTCTTAAAACAACTTCTTAATACCCTTCAAAATCTTACCCAAAATTCTTTTAGCTTCAGCCTCTCTTTTC 3′，其中TTCGAA为BstBⅠ的酶切位点；GAATTC为EcoR Ⅰ的酶切位点，目的基因设计在下游引物上，以质粒pPICZαA为模板，PCR扩增得到含有目的基因和α信号肽的片段；将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化；(2)多拷贝IsCT衍生物重组质粒的构建单拷贝重组质粒pPICZαA‑IsCT用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ双酶切后，将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后回收表达盒段并纯化；同时用BamH Ⅰ线性化质粒pPICZαA‑IsCT，并去磷酸化后，用T4连接酶连接，得到二拷贝质粒pPICZαA‑(IsCT)2，重复这个过程，得到更多拷贝数的IsCT衍生物；(3)毕赤酵母分泌表达IsCT衍生物重组质粒的构建质粒pPICZαA和含有目的基因的片段同时用BstB Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，构建重组质粒pPICZαA‑IsCT；然后用CaCl2法转入E.coli感受态细胞，在Zeocin+LBL平板上涂板，过夜培养；提取阳性转化子质粒进行BstB Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定；(4)重组毕赤酵母的构建和筛选以Mss Ⅰ线性化重组质粒pPICZαA‑IsCT，采用电转化宿主菌P.pastoris X33于Zeocin+YPDS平板上涂板，28‑32℃培养2‑3d，随机挑选转化子进行菌落PCR鉴定；(5)重组菌的摇瓶发酵诱导表达将筛选得到的重组转化子X33/pPICZαA‑IsCT接种于10mL BMGY培养基中，30℃，200r/mim震荡培养16‑20h至OD600＝2‑6；离心收集菌体，再将X33/pPICZαA‑IsCT悬浮于25mL BMMY培养基中，并使起始OD600＝1，继续震荡培养，每隔24h向BMMY培养基中补加1％的甲醇，得到重组菌，即为蝎源抗菌肽IsCT衍生物，并分析重组菌的生长曲线和IsCT衍生物的抗菌活性。