[发明专利]一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法及其基因和应用

摘要

本发明提供了一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的优化基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因可在毕赤酵母表达系统中高效表达，从而制得耐碱高温甘露聚糖酶ManB，该酶在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。本发明还提供了一种含有该优化基因的重组表达质粒，以及一种生产该耐碱高温甘露聚糖酶ManB的毕赤酵母重组菌株。该菌株所分泌的甘露聚糖酶ManB在发酵液中的蛋白质含量达到电泳纯级别，几乎不需要纯化，降低生产成本。

主权项

一种耐碱高温甘露聚糖酶ManB的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、在不改变甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列的条件下，对其进行基因重排和优化密码子，去除毕赤酵母稀有密码子，并提高mRNA的二级结构稳定性，获得优化的甘露聚糖酶ManB基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）、将步骤（1）中甘露聚糖酶ManB基因的5'端和3'端位置分别设计EcoR I和Not I酶切位点，完成全基因合成后插入表达载体pPIC9K，构建重组质粒pPIC9K‑ManB；（3）将步骤（2）中重组质粒pPIC9K‑ManB采用Dra I线性化该重组质粒后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，并筛选获得产酶最高的重组毕赤酵母菌株ManB‑GS115；（4）将步骤（3）中重组毕赤酵母菌株ManB‑GS115接种于毕赤酵母发酵培养基，并维持甲醇诱导产酶，从而获得甘露聚糖酶ManB。