[发明专利]I型登革病毒KMB17细胞适应株的培育及其制备方法

摘要

本发明公开一种I型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，能将流行的I型登革病毒株适应于人胚肺二倍体细胞KMB17上生长，获得在KMB17细胞上稳定传代且病毒复制能力较强的细胞适应株，经过多次噬斑纯化的方法获得纯度较高的纯化适应株。经对病毒进行系列鉴定，I型登革病毒纯化株保持了较好的抗原性以及原始毒株的基本生物学特性。通过本发明使I型登革病毒KMB17细胞适应株能够以人胚肺二倍体细胞KMB17为基质，进行I型登革病毒扩增，打破了I型登革病毒宿主细胞的局限性，为加快登革病毒预防性疫苗的研发开拓新的思路，为I型登革病毒灭活和减毒活疫苗的研发奠定了基础，同时也具备大规模生产的可行性。

主权项

一种I型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得：1）、按1 ml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0 MOI的I型登革病毒液接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，按1:9的体积比补加下列培养液： MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为33+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按3.5%的体积比补加体积浓度为7%w/v的NaHCO3, 培养9‑10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置‑20℃反复冻融3次，收集细胞培养液，于4℃3500×g离心10分钟，收集上清，获得病毒液；2）、将步骤1）所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，控制病毒浓度为4.0 MOI，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3，1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺，1%体积比的抗生素，在温度为33+0.5℃， CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第五天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养9‑10天，显微镜下观察细胞出现CPE达++++时，将细胞培养瓶放置‑20℃反复冻融3次，收集细胞培养液，于4℃3500×g离心10分钟，收集上清，获得病毒液；如此反复连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的I型登革病毒液；3）、按1ml病毒液/瓶的量，将步骤2）所得传代稳定的I型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，并控制病毒浓度为4.0 MOI，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，在相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置‑20℃冻融3次，收集细胞液，4℃ 3500×g离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液并于‑70℃下保存；4）、将步骤3）获得的病毒液反复冻融2次，于4℃，3500×g离心分离10min，收获上清，得病毒液；将该病毒液按1ml病毒液/瓶的量，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，按1:9的体积比补加下列培养液：MEM培养基+5%体积比的胎牛血清+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，在温度为35+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；培养至第三天时，于相同环境条件下，按2%的体积比补加体积浓度为7%的NaHCO3, 培养7天，显微镜下观察细胞出现CPE时，将细胞培养瓶放置‑20℃冻融3次，收集细胞液，4℃ 3500×g离心10分钟，无菌条件下收集上清，获得病毒液，如此反复连续传代培养10代以上，至KMB17细胞CPE达++++时，即筛选出能在KMB17上稳定传代增值的I型登革病毒细胞适应株；5）用KMB17细胞对步骤4）筛选出的能在KMB17上稳定传代增值的I型登革病毒细胞适应株进行下列噬斑筛选纯化：弃去6 孔板中已生长成单层的KMB17细胞的培养液，用Hanks 液漂洗2 次；在不含血清的下列维持液中：MEM培养基+3.5%体积比的体积浓度为7%的NaHCO3+1%体积比的体积浓度为3%的L‑谷氨酰胺+1%体积比的抗生素，将步骤4）的I型登革病毒细胞适应株稀释至4.0MOI浓度后，接种KMB17细胞，置37+0.5 ℃孵育4h，每隔15min 轻轻水平晃动培养板数次，以保证病毒与细胞充分接触；吸附完毕后吸出病毒液，加1mL 含有0.1 %体积比的中性红及5%体积比的胎牛血清的MEM琼脂糖培养基,于37+0.5℃，CO2体积浓度为5%的环境中恒温培养；2天后每天观察2次，记录蚀斑出现和生长情况，直至大小适宜时，吸取斑点，以维持液稀释后接种96孔板，收集病变孔的培养液；如此进行3 轮噬斑纯化；通过实验，3轮噬斑纯化均在3天后出现微小斑点，至5‑6天斑点直径长至约8‑10um，筛选出I型登革病毒适应株；此毒株即为能在人胚肺二倍体细胞KMB17上增殖的纯化I型登革病毒适应株；6）将步骤5）收获的纯化I型登革病毒适应株按照步骤4）在人胚肺二倍体细胞KMB17上增殖、分装，于‑70℃下长期保存，备用。