[发明专利]一种野生奥德蘑种类的鉴定方法

摘要

本发明涉及一种野生奥德蘑鉴定方法，包括：（1）野外采集；（2）外部形态鉴定；（3）微观结构鉴定；（4）分子序列鉴定；（5）综合鉴定：综合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，准确确定野生奥德蘑的种类。本发明与常规形态学鉴定相比，具有鉴定准确性高、定位准确的优点，在我国奥德蘑品种的鉴定中具有代表性。

主权项

一种野生奥德蘑鉴定方法，包括下列步骤：（1）野外采集先对从野外采集的野生奥德蘑子实体进行拍照，拍摄清楚菌盖、菌柄、菌环和菌褶以及子实体周围的生境；照片拍摄后采集奥德蘑野生子实体，测量并记录其外部形态特征，并进行菌种分离；（2）外部形态鉴定将步骤（1）采集到的野生奥德蘑子实体的外部形态特征和现有的奥德蘑子实体的外部形态特征进行比对，找出相似种类；（3）微观结构鉴定将步骤（1）得到的奥德蘑野生子实体进行显微结构观察，然后将野生奥德蘑与步骤（2）得到的相似种类的奥德蘑的显微结构进行比对，找到显微结构相似的种类；（4）分子序列鉴定1）DNA提取：提取总DNA，测定浓度后调节至100ng/μL备用；2）PCR扩增：选用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增奥德蘑核糖体RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反应体系总量20μL，包含有Taq酶5U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP各200μmol/L、引物各1.0×10‑5μmol、模版DNA100ng；PCR反应程序94℃预变性5min，30个循环中94℃ 50s、51℃ 50s、72℃ 1min，最后72℃延伸10min；3）PCR测序：经ITS扩增片段进行双向测序，测序结果经过比对拼接后确定最终序列；4）ITS序列分析：将测序好的序列在Genebank中进行Blast比对；（5）综合鉴定：综合外部形态特征、微观结构和分子序列比对的种类，综合比较，准确确定野生奥德蘑的种类。