[发明专利]一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，由构建含rrsB‑trnI‑trnA‑rrsL同源重组片段的骨架载体、构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体、构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体组成。本发明采用质体遗传转化的思路，为质体遗传转化提供载体基础，以期实现质体遗传转化外源基因表达效率高、来自原核的基因无需修饰改造、安全性好、易保持纯系、后代不分离的优势。

主权项

一种条斑紫菜质体遗传转化载体的构建方法，包括以下步骤：(1)构建含rrsB‑trnI‑trnA‑rrsL同源重组片段的骨架载体，①质体同源重组片段的克隆，以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物XhoI‑PyT‑F1 5′‑CCGCTCGAGGAATCACTGGGCGTAAA‑3′SacI‑PyT‑R1 5′‑CGAGCTCTTCGCTAATGCTTCAAACTA‑3′进行PGR扩增，所述正反向引物5′端分别添加了XhoI和SacI酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物的3′末端为序列1 5′端第1‑18寡核苷酸序列，所述反向引物的3′末端为序列1 3′端第1‑20碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19‑T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；②用XhoI/SacI双酶切pBluescript SK载体和步骤①中所得重组质粒，切胶回收2890bp和2500bp片段，用T4DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含rrsB‑trnI‑trnA‑rrsL同源重组片段的骨架载体；(2)构建含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，①以条斑紫菜质体基因组为模板，用下述正向和反向引物ClaI‑PypsbA‑F1 5′‑CCATCGATGCAAAAGTTTGTACGAGT3′HindIII‑PypsbA‑R1 5′‑CCCAAGCTTCTACCTTATGCTGATTAT‑3′对psbA序列进行PCR扩增，所述正反向引物5′端分别添加了ClaI和HindIII酶切位点和几个保护碱基，且所述正向引物的3′末端为序列4 3′端第1‑18碱基反向互补的寡核苷酸序列，所述反向引物的3′末端为序列3 5′端第1‑18寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD18‑T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；②抗生素筛选基因的克隆，以为模板，用下述引物Afe I‑cat‑F1 5′‑TCTGAGCGCTATGGAGAAAAAAATCACTGG‑3′Pac I‑cat‑R1 5′‑GCTTAATTAATTACGCCCCGCCCTG‑3′PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因cat基因，所述正反向引物5′端分别添加了Afe I和Pac I酶切位点和多个保护碱基，且所述正向引物的3′末端为序列2 5′端第1‑20寡核苷酸序列，所述反向引物的3′末端为序列2 3′端第1‑15碱基反向互补的寡核苷酸序列，将扩增产物与pMD19‑T载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒；③将上述步骤①和步骤②所得重组质粒用Afe I/Pac I双酶切，切胶回收3600bp和660bp片段，用T4DNA Ligase连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，菌落PCR检测，得到重组质粒，即含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体；(3)构建条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体，用ClaI/HindIII双酶切步骤(2)中所得的含抗生素筛选基因表达盒的条斑紫菜质体表达载体，回收cat基因表达盒，再用T4DNA Polymerase补平，插入到经过AvrII单酶切、末端平化、去磷酸化的步骤(1)所得的含rrsB‑trnI‑trnA‑rrsL同源重组片段的骨架载体中，最终构建成含筛选标记基因cat表达盒、用于条斑紫菜质体基因组定点整合表达的载体pYVC。