[发明专利]基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法

摘要

本发明涉及基于亲和色谱测定解离速率常数的方法，特别是针对相互作用较弱、较广泛的超分子相互作用。所述方法是将主分子先进行固定再测定的基于定量亲和色谱的方法。所述方法包括：在一定温度条件下，在多个流速下分别采集第一待分析客分子与第二待分析客分子在键合有目标主分子的亲和色谱柱上的色谱流出曲线，通过峰拟合计算保留时间、半峰宽及塔板高度，计算解离速率常数。本发明无需特殊仪器设备，利用常规色谱分析方法，可测得超分子弱相互作用的动力学速率常数，同时可与紫外、荧光及质谱等多种检测器联用，在低浓度、水溶性差的药物检测方面，以及超分子相互作用动力学参数的低成本、快速测定方面具有独特优势。

主权项

一种基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法，该方法包括以下步骤：（1）提供一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；（2）用流动相制备一定浓度的第一待分析客分子的样品溶液；（3）以带流出方式将所述第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入色谱系统，采集第一待分析客分子在亲和色谱柱上的流出曲线，并通过峰拟合计算第一待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（HR）；（4）用与第一待分析客分子相同的流动相制备第二待分析客分子的样品溶液；（5）采用与第一待分析客分子相同的方式获得第二待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（HM,C）；（6）按照（1）～（5）中所述的方法重复测定其他至少三个不同流速下的HR和HM,C；（7）比较各个HR与HM,C的大小，若三分之二数目以上的HR>HM,C，则以HM,C作为HM采用公式（3）通过HR‑HM对uk/(1+k)2做线性回归，由斜率计算kd,app：HR-HM=2ukkd,app(1+k)2---(3)]]>其中，u为线速度，k为容量因子；若三分之二数目以上的HR<HM,C，则按照一定的校正方法对HM,C进行校正，得到HM,T，并采用校正后的HM,T作为HM按照公式（3）计算kd,app；（8）按照（1）～（7）中所述的方法测定第一待分析客分子在空白色谱柱上的容量因子kcontrol和解离速率常数kd,control；（9）通过第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子比值判断第一待分析客分子与空白基质相互作用的强弱，并采用公式（4）计算kd。（αcontrol为kcontrol与k的比值，α1=1‑αcontrol）1kd,app=α1kd+αcontrolkd,control---(4).]]>