[发明专利]一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法

摘要

本发明公开了一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，所述的分离方法步骤为：1）生物素标记抗精子膜蛋白抗体；2）精子与抗体的结合；3）磁珠与抗体-精子复合体的结合；4）精子与上皮细胞的分离；5）精子与磁珠的分离。本方法利用生物素标记抗精子膜蛋白抗体，通过亲和素（包被在磁珠上）偶联生物素，成功构建了磁珠-亲和素-生物素-抗体-膜抗原（精子）复合体，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高混合斑检验的能效；具有流程少、操作简单、便于普及等优点，可为自动化检验提供理论及实践基础。

主权项

一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤：1）生物素标记抗精子膜蛋白抗体：向浓度为5mg/mL的MOSPD3抗体或浓度为5mg/mL的Anti‑SPAG8抗体中加入浓度为1mg/mL的Sulfo‑NHS‑LC‑Biotin，抗体与Sulfo‑NHS‑LC‑Biotin的体积比为10:3～5，在离心管中混匀后3～5℃反应48～72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.01mol/L，pH7.2的PBS3～5℃透析12～24小时；得到MOSPD3‑生物素偶联物或Anti‑SPAG8生物素偶联物；2）精子与抗体的结合：向精子与上皮细胞混合悬液中加入上述生物素标记的MOSPD3抗体或Anti‑SPAG8抗体，置于Thermomixer comfort上孵育；离心，弃去上清液后加入预冷的洗涤液，震荡后离心，弃去上清，得到抗体‑精子复合体；3）磁珠与抗体‑精子复合体的结合：向步骤2）得到的抗体‑精子复合体中加入吸附液，震荡混匀后加入过量磁珠，室温孵育30～45分钟；4）精子与上皮细胞的分离：将步骤3）中的离心管置于磁分离架上吸附5～10分钟，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；5）精子与磁珠的分离：向步骤4）中的离心管内加入300～500μL洗脱液，震荡，56～65℃放置5～10分钟后再次置于磁分离架上吸附3～5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。