[发明专利]检测S100A11的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒

摘要

试剂盒包括：30nm粒径的超顺磁性复合微粒；偶联液；封闭液；洗涤液；加样缓冲液；荧光增强液；检测缓冲液；捕获抗体；检测抗体；Eu3＋标记的链亲和霉素；标准品。其使用包括：该试剂盒采用纳米磁珠分选和以双抗体夹心法为基础的时间分辨免疫荧光原理来检测样品中的S100A11蛋白的浓度。用偶联有S100A11捕获抗体的纳米磁珠富集样品中的S100A11，并加入检测抗体孵育，洗涤后加入Eu3＋标记的链亲和霉素孵育，通过再次洗涤加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的S100A11浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。待检样品还可以用于下一个目的蛋白的检测。

主权项

检测S100A11的纳米磁珠分选‑时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于包括以下组成：（1）30nm粒径的超顺磁性复合微粒；（2）偶联缓冲液；（3）磷酸盐缓冲液（PBS），其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH值为7.4；（4）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；（5）洗涤液为含0.05%Tween‑20的Tris‑HCl 缓冲液（TBS），其成分为50mM的Tris‑HCl 缓冲液（pH 7.8），0.05%Tween‑20；（6）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；（7）荧光增强液（Enhancement Solution）；（8）检测缓冲液（Assay Buffer）为50mM的Tris‑HCl 缓冲液（pH 7.8），其中含有1%BSA，1%bovine globulin，0.05%Tween 40，DTPA； （9）包被抗体为单克隆小鼠抗人S100A11抗体（Monoclonal Anti‑Human S100A11 Antibody），储存浓度为1μg/μl；（10）检测抗体为生物素化的羊抗人S100A11多抗（Biotinylated Anti‑Human S100A11 Antibody），储存浓度为50ng/μl；（11）Eu3＋标记的链亲和霉素（Eu3＋‑labeled streptavidin），储存浓度为0.1μg/μl；（12）标准品，重组人S100A11蛋白（Recombinant Human S100A11），浓度为100μg/μl。 2. 如权利要求1所述检测S100A11的纳米磁珠分选‑时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤：（1）用1ml偶联液溶解500μg单克隆小鼠抗人S100A11抗体，加入30nm粒径的超顺磁性复合微粒，轻摇混匀，置于恒温摇床，37℃、180 rpm 振荡反应20min，反应完毕，磁性分离2 min； （2）在上述离心管中加入1 ml 洗涤液，轻摇混匀，磁性分离，重复该清洗操作1次；（3）在离心管中加入3 ml封闭液，置于恒温摇床，37℃、180 rpm 振荡反应2 h，磁性分离，弃上清；（4）在离心管中加入1 ml 洗涤液，轻摇混匀，磁性分离，弃上清，重复该清洗操作3次；（5）在500μl待测培养上清样品和倍比稀释的标准品中加入纳米磁珠偶联的抗体2μl，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，1h；（6）将上述1.5ml Ep管置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后将500ul血清全部取出后冻存；（7）将上述1.5ml Ep管置于磁性分离器上，用500μl PBS‑0.05%Tween20洗涤三次；（8）加入稀释好的检测抗体Biotinylated Anti‑Human S100A11 Antibody（Detect Antibody）100μl/管，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，1h；（9）将上述1.5ml Ep管重新置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后弃去检测抗体，用500μl Wash Buffer洗涤三次；（10）加入用Assay Buffer 配制的Eu‑labeled streptavidin 100μl/孔，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，避光，1h；（11）将上述1.5ml Ep管重新置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后弃去Eu‑labeled streptavidin，500μl/孔Wash Buffer洗涤四次； （12）加入Enhancement Solution 200μl/孔，混合均匀后，将200μl液体加于96孔检测板中，室温避光孵育45min并Slowly Shaking 5min；（13） 读板：设定激发光波长（Excitation wavelength）为337nm，发射光波长（Emission wavelength）为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；（14）利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；（15）通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的S100A11的浓度。