[发明专利]从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法

摘要

本发明提供了一种从血液中分离、培养细胞的方法以及一种对非人动物进行克隆的方法。所述从血液中分离、培养细胞的方法包括以下步骤将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞；将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。该方法获得的体细胞核移植的供体细胞可以直接用于手工克隆非人动物，不仅操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利。

主权项

一种从血液中分离、培养体细胞核移植的供体细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将12mL外周血收集于装有125IU肝素的离心管中，混匀，得到抗凝外周血；(2)向装有5mL的密度为1.077g/mL，含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠的中性粒细胞分离液中加入5mL所述抗凝外周血，保证所述抗凝外周血不与下层的中性粒细胞分离液混合，然后在400g条件下水平离心30分钟，收集中间层云浮状单个核细胞；(3)重复步骤(2)一次，并将两次所得到的中间层云浮状单个核细胞合并于离心管中；(4)向步骤(3)所述离心管中加入20mL PBS缓冲液，进行吹洗，并在300g条件下离心10分钟，收集沉淀；(5)将所述沉淀重复步骤(4)的操作2次，收集沉淀，得到单个核细胞；(6)将所述单个核细胞接种于含有低糖‑MEM、15％FBS、1×非必需氨基酸、10ng/mL的bFGF和30IU/mL肝素的第一贴壁细胞培养基，并将含有所述单个核细胞的第一贴壁细胞培养基转移至明胶包被的35mm培养皿中，然后放置在37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行培养；当培养至48、72和96小时时，将培养基更换为含有MEM‑α、15％FBS、1×非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF的第二贴壁细胞培养基，继续在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养，培养5～7天，获得贴壁细胞；(7)用PBS缓冲液润洗所述贴壁细胞2次，弃去PBS缓冲液后，向载有所述贴壁细胞的培养皿中加入200μL 0.05％胰酶‑200mg/L EDTA，并置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行消化，当在显微镜下观察到贴壁细胞逐渐变圆变亮并逐渐脱离培养皿而漂浮于细胞胰酶中时，向培养皿中加入1mL所述第二贴壁细胞培养基，混匀，以便获得细胞悬液；(8)将所述细胞悬液转移到经过明胶包被的培养设备中进行传代培养2～20代，以便获得体细胞核移植的供体细胞。