[发明专利]一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）-羧基-2,7-二氯二氢荧光素二特戊酸酯，包括染料底层、蛋白酶固定层、顶层保护层。本发明所使用的方法具有高度的选择性，作为蛋白质酶，其对反应物具有高度的特异性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反应，对其他的反应底物都没有催化活性，由于检测过程中涉及到三种高度特异性的酶，本方法的选择性更是呈指数增加，试剂盒最后给出的响应是荧光响应，相与某些检测颜色变化的方法相比，荧光响应的固有特性赋予本发明更高的灵敏度以及抗干扰的能力。

主权项

一种三层结构的肌酸酐含量检测试剂的制备方法，其特征在于：检测试剂包括：肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，荧光染料5（6）‑羧基‑2,7‑二氯二氢荧光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成为肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸随之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的过氧化氢，在辣根氧化物酶的催化下，过氧化氢催化氧化了5（6）‑羧基‑2,7‑二氯二氢荧光素二特戊酸酯并生成具有荧光响应的产物，通过监测荧光增强的速率以及标准曲线，获得肌酸酐浓度，其中所述肌酸酐酶：肌酸酶：肌氨酸氧化酶：辣根过氧化物酶：荧光染料的重量比为：1：50：60：5；三层结构为：⑴染料底层：将荧光染料修饰过的纤维素和D4水凝胶混合并搅拌，在一张干净的塑料薄膜上用刮刀涂膜机涂上一层D4水凝胶的薄膜并使之自然风干；⑵蛋白酶固定层：在PVA‑Sbq（聚丙烯醇‑苯基吡啶乙烯络合物）的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反应所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，搅拌25‑40分钟以上，用刮刀涂膜机涂上一层酶的PVA‑Sbq溶液，将紫外灯置于膜层的上方30分钟，使苯基吡啶乙烯交联并使膜层变干；⑶顶层保护层：最后在上面用刮刀涂膜机涂上一层含有10%炭黑的D6水凝胶，并使膜层自然风干；三层结构的具体制备步骤如下：⑴将176mg纤维素固定的5（6）‑羧基‑2,7‑二氯二氢荧光素二特戊酸酯和2.6g的4%D4水凝胶溶液混合并搅拌均匀，使纤维素粉末在溶液中均匀分散；⑵将步骤⑴中所制备的溶液均匀在塑料薄膜上使之形成一层厚度为100uM的薄膜并晾干；⑶将30mg肌酸酶、35mg辣根过氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g浓度为10%并含有10%牛血清蛋白的PVA‑Sbq溶液混合，并在冰上搅拌均匀；⑷在步骤⑵中制备的薄膜上涂上步骤⑶中所制备的PVA‑Sbq/酶溶液，膜层的厚度为100μm，将薄膜置于紫外灯下30分钟；⑸在步骤⑷中所制备的薄膜上涂上一层含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然风干。