[发明专利]一种可再生性固定化酶反应器的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种可再生性固定化酶反应器的制备方法及应用。先在2.5mL针管底部合成一层机械强度高、渗透性强的有机薄层，然后在针管有机薄层上填充表面拥有氨基的硅球，最后用戊二醛激活并共价固定化胰蛋白酶，实现针管小柱里高通量的扩大化酶反应器的制备。再生途径是通过用HCl调节pH使得席夫碱反应获得的-C=N-双键在酸性条件下发生水解反应，-C=N-双键断裂，再次用戊二醛激活可实现了固定化酶反应器的再生；该方法制备的固定化酶反应器应用于酶解蛋白制备多肽。本发明具有制备过程简单、酶解样品容量高、可再生性和可反复使用等优点。所制备的固定化酶反应器具有高通量、高效和快速的酶解能力。

主权项

一种可再生性固定化酶反应器的制备方法，其特征在于具体步骤为：(1)将MAA即α‑甲基丙烯酸、十二醇和乙腈按照体积比1:23~24:5~6混合均匀，超声30分钟，再加入EGDMA即乙二醇二甲基丙烯酸酯和AIBN即偶氮二异丁腈后继续超声15分钟，制得混合液；所述EGDMA的体积与MAA、十二醇和乙腈三者的体积之和的比为1:2.7~2.8；所述AIBN的质量与MAA、十二醇和乙腈三者的体积之和之比为1毫克:143~144微升；(2)取300微升步骤(1)制得的混合液加入至底部预先用保鲜膜封口的2.5 毫升的医用注射器中，振动排气后将针筒垂直于地平面放置，并于58~62℃下原位聚合反应23~25小时，即制得针筒底部有机薄层，然后用5 毫升体积比为9:1的甲醇‑乙酸混合溶液洗去有机薄层上残余的十二醇，再用5毫升无水乙醇洗去甲醇‑乙酸混合溶液，然后将针筒用1毫升无水乙醇浸泡，室温下保存备用于酶的固定化；(3)将TEOS即正硅酸乙酯、APTES即 3‑氨基丙基三乙氧基硅烷、无水乙醇和水按照体积之比为3.5:3.6~3.7:6.7~6.8:1混合，室温下磁性搅拌12 小时，然后放置于恒温箱里90℃下烘干3~4 小时，最后碾磨过筛即可制得氨基化硅球；(4)称取0.25克步骤(3)制得的氨基化硅球置于小烧杯里，加入2 毫升体积百分数为 0.01%的戊二醛无水乙醇溶液浸泡1小时，然后把被浸泡过的氨基化硅球倒入步骤(2)制备好的针筒里，最后用5毫升摩尔浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的磷酸缓冲液洗去残余的戊二醛，制得戊二醛激活后的针筒；(5)取2 毫升 10.0 毫克 /毫升的胰蛋白酶溶液加入步骤(4)制得的戊二醛激活后的针筒里，在10分钟内让胰蛋白酶溶液穿过针筒底部有机薄层全部流出针筒，使胰蛋白酶上的氨基与戊二醛的醛基通过席夫碱反应形成‑C=N‑双键而实现酶共价固定化到氨基化硅球表面，接着用5毫升摩尔浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的磷酸缓冲液洗去未固定化的胰蛋白酶，即制得固定化胰蛋白酶反应器；(6)步骤(5)制得的固定化胰蛋白酶反应器经过多次使用或长时间放置使活性降低，通过HCl调节pH值使得席夫碱反应形成的‑C=N‑双键在酸性条件下发生水解反应断裂，加入2 毫升体积百分数为 0.01%的戊二醛无水乙醇溶液浸泡1小时，再用5毫升摩尔浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的磷酸缓冲液洗去残余的戊二醛，重新制得戊二醛激活后的针筒，然后重复步骤(5)的操作，即实现固定化胰蛋白酶反应器的再生；所述化学试剂的纯度均为分析纯及以上纯度。