[发明专利]一种甜瓜种子纯度检验的方法

摘要

发明公开了一种甜瓜种子纯度检验的方法，特别是一种利用SSR分子标记对金露三号甜瓜种子进行纯度检验的方法。其利用一对SSR引物FLWSSRL和FLWSSRR对甜瓜杂交品种金露三号的父母本和杂交一代的基因组DNA进行扩增和琼脂糖凝胶电泳分离，找出杂交一代与父母本差异的特征谱带，通过受检种子纯度计算，对金露三号杂一代种子样品进行检验，其检验的纯度经与田间种植鉴定的纯度对照比较，二者的结果高度一致。适用于对金露三号及其亲本真实性和种子纯度的检验。

主权项

一种甜瓜种子纯度检验的方法，按下述步骤操作：1）DNA提取：a)将甜瓜种子置于营养钵中发芽出苗，等到幼苗有2‑3片真叶时，取2.5‑3.5cm2的叶片于小研钵中，加入4×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管，65℃水浴半小时；b)加入与提取缓冲液等体积的的苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液，12000rpm离心10分钟，吸其上清置于另一离心管，加入冰冻无水乙醇，‑20℃冰柜内放置60分钟沉淀DNA；c)12000rpm离心10分钟，弃上清；加浓度为75%的乙醇，静置4分钟去盐，弃去乙醇；d)离心管置于加热通风烘箱中，65℃风干；e)加灭菌双蒸水溶解待用；上述4×CTAB提取缓冲液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵,1.4mol/L的氯化钠NaCl，0.1mol/L的Tris‑Cl缓冲液（pH8.0），0.02mol/L的乙二胺四乙酸和0.2%（v/v）的α‑巯基乙醇构成；上述苯酚‑氯仿‑异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为1：24︰1；2）PCR反应：在PCR管中分别加入DNA模板、改性缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及双蒸水；先94℃预变性4分钟；再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，32个循环；72℃延伸7分钟，95℃水浴4分钟变性后置冰上；上述改性缓冲液为10×PCR缓冲液+2×10‑3mol/L氯化镁；上述引物FLXGSSRL序列为5’‑GATTCATTAGGCGGTGAG‑3’；上述引物FLXGSSRR序列为5’‑CGTGGGTTGATTGATGTTGT‑3’；3）琼脂糖凝胶电泳检测：将琼脂糖加入100ml的5×TBE中搅拌混合均匀后加热，配制成浓度为3%的琼脂糖溶液，室温下冷却至55‑65℃，每200ml琼脂糖溶液中加入0.5μg的核酸染料sybe Green I，倒入专用琼脂糖制胶模板内，插梳；待琼脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，将凝胶放入具有1.5×TBE电泳液的电泳槽中，以电泳液高出凝胶0.5cm为宜，点样；设定电压200V，电泳半小时，关闭电源，使用紫外凝胶成像系统拍照；4）受检种子纯度计算：用上述方法分别获取甜瓜杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100%。