[发明专利]一种磷酸化肽聚糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种磷酸化肽聚糖的制备方法，特点是包括将嗜酸乳杆菌接种于培养基培养，离心收集菌体反复洗涤，将菌体悬浮于氢氟酸溶液中4℃过夜，离心收集细胞壁沉淀洗涤至中性；将沉淀溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中沸水灭活，取上清液离心后沉淀洗涤；将沉淀溶于乙醚中，搅拌离心收集沉淀用水洗涤至无乙醚味得肽聚糖的步骤；将肽聚糖溶于溶菌酶磷酸缓冲液中酶解离心取上清液，再将上清液离心取沉淀用水离心洗涤得到小分子肽聚糖的步骤；最后将小分子肽聚糖溶于混合磷酸盐溶液中反应后用乙醇沉淀，将醇沉肽聚糖冷冻干燥复溶，复溶后的溶液置于透析袋中透析浓缩后冷冻干燥得磷酸化肽聚糖的步骤，优点是溶解性显著增加、免疫效应有所提高。

主权项

一种磷酸化肽聚糖的制备方法，其特征具体包括以下步骤：（1）肽聚糖的制备 a.菌体收集：将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比3‑5%的接种量接种于MRS液体培养基，37‑40℃恒温培养箱静置培养16‑24h，5000‑8000r/min离心10‑20min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色； b.去磷壁酸：将步骤a得到的菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为40‑50%的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，7000‑9000 r/min离心10‑20min收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；c.酶解破壁：将步骤b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，37‑40℃摇床110‑130r/min振荡15‑17h，沸水浴灭活4‑6min，于1500‑2500r/min的转速下离心4‑6min，弃去未溶解的蛋白酶沉淀，将上清液于8000‑12000r/min离心10‑20min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤； d.除脂：将步骤c洗涤后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌3‑5h后，7000‑9000r/min离心10‑20min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；（2）降低分子量： 将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，36‑38℃搅拌酶解6‑10h，于1500‑2500r/min的转速下离心4‑6min，取上清液，再将上清液于8000‑12000r/min离心10‑20min，取沉淀用蒸馏水离心洗涤得到小分子肽聚糖；（3）混合磷酸盐修饰 将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于浓度为0.003‑0.006g/ml的复合磷酸盐溶液中，75‑85℃反应4‑6h后，再将反应液用8倍反应液体积的95%乙醇沉淀20‑28h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于55‑65℃水浴中复溶，复溶后的溶液置于截留分子量为7000的透析袋中，以蒸馏水为透析液透析2‑3天后，将透析袋内液体浓缩到2‑5ml后，进行冷冻干燥得到磷酸化肽聚糖。