[发明专利]一种蜡蚧菌几丁质酶分离纯化的方法

摘要

本发明公开了一种虫生真菌蜡蚧菌菌株几丁质酶的分离纯化方法。将蜡蚧菌在优化后的产酶培养基中发酵，经硫酸铵沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析、SephadexG-100凝胶过滤层析等步骤于发酵液获得了SDS-PAGE电泳均一的蜡蚧菌几丁质酶，本工艺特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

主权项

一种从蜡蚧菌分离纯化几丁质酶的方法，其特征在于包括以下步骤：（a）粗酶液的制备: 用优化试验筛选出的培养基培养蜡蚧菌L. lecanii FJ28，利用DNS试剂比色法，每隔24h取菌培养液进行测定，当几丁质酶活性达最高时取发酵液离心，上清液用真空抽滤，收集滤液；向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%wt，4℃静置过夜；再次离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀至完全；离心溶解液除去不溶物体，上清液装于透析袋，经磷酸盐缓冲液透析后，再用聚乙二醇PEG20000浓缩得到粗酶液；(b) DEAE A‑52阴离子交换层析:粗酶液经过聚乙二醇PEG20000浓缩后，用磷酸盐缓冲液平衡过夜，上样于充分平衡后的DEAE A‑52 阴离子交换层析柱，用磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含0‑1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液进行连续洗脱,收集洗脱液； (c)Sephadex G‑100 凝胶过滤层析:用磷酸盐缓冲液充分平衡Sephadex G‑100凝胶层析柱；将步骤（b）后的样品上样，再用0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液； 步骤（a）（b）（c）中磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，pH=6.5；步骤（b）中含0‑1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，pH=6.5。