[发明专利]一种外源基因可移除的慢病毒受控表达载体系统及应用

摘要

本发明公开一种外源基因可移除的慢病毒受控表达载体系统及应用。该系统包括反应/调节质粒和包装质粒，构建方法：通过定点突变，将loxP序列插入pSMPUW 3’LTR，将TRE和最简化CMV启动子取代原启动子，并将源性报告基因插入MCS，得反应质粒；将CMV-rtTA2S-M2序列、EMCV序列及Cre-ER序列插入定点突变的pSMPUW，得调节质粒。应用：包装得反应/调节慢病毒；将二者共转染靶干细胞，用Dox诱导外源性报告基因表达并进行显像示踪，最后用4-OH-tamoxifen诱导切除外源性报告基因。本发明实现了外源性报告基因在体内的受控表达，还可即时将其移除，避免其对靶细胞正常生理功能的干扰。

主权项

一种外源基因可移除的慢病毒受控表达载体系统，该系统包括表达质粒和包装质粒，其特征在于：所述表达质粒包括反应质粒和调节质粒，并分别通过如下方法构建获得：（1）反应质粒的构建通过慢病毒载体pSMPUW3’LTR U3区域部分碱基的定点突变引入酶切位点，将loxP序列插入所述pSMPUW3’LTR，得突变质粒；用Tet‑on系统反应质粒pTRE‑Tight上的顺式作用元件TRE和最简化CMV启动子序列取代所述突变质粒的启动子序列，并将外源性报告基因插入所述突变质粒的多克隆位点MCS位置，得反应质粒；所述外源性报告基因处于所述TRE和最简化CMV启动子控制之下，并由Dox诱导表达。（2）调节质粒的构建将Tet‑on系统中的CMV‑rtTA2S‑M2序列、内部核糖体进入位点EMCV序列以及Cre‑ER序列顺序连接起来，插入步骤（1）中定点突变的pSMPUW的多克隆位点区域，得调节质粒；所述rtTA2S‑M2序列和Cre‑ER序列能各自独立地进行翻译和表达，生成rtTA2S‑M2蛋白及Cre重组酶雌激素受体融合蛋白。