[发明专利]一种简便的植物BY-2细胞冷冻保存方法

摘要

一种简便的植物BY-2细胞冷冻保存方法，将BY-2细胞在8％蔗糖液体培养基中预培养，然后在冷冻保护剂(山梨醇、二甲基亚砜)的存在下，采用降温冷冻步骤，经过4℃，-20℃，-40℃分阶段降温处理，最后于-80℃保存备用。细胞复苏时采用快速融化法融化冷冻细胞液，离心去上清液后换入新鲜培养基进行培养即可使用。该方法简单易行，减少了液氮冷冻保存的损耗。冷冻保存后的细胞有较高的存活率，能够解决实验室在细胞的培养和使用中存在的人力、物力的消耗和细胞质量降低等问题，可以作为生物实验室的通用技术。

主权项

一种简便的植物BY‑2细胞冷冻保存方法，其特征在于，它包括如下步骤：A.预培养：将烟草叶片的愈伤组织在含8％的蔗糖液体培养基中预培养5天；B.冷冻保护剂的预处理：将预培养后的细胞悬浮液4℃800rpm离心5min，吸去上清液后保留2ml细胞液转移至冷冻保藏管中，然后在保留的细胞液中加入冷冻保护剂，密封；C.加入冷冻保护剂：冷冻保护剂包括50％山梨醇0.572ml、二甲基亚砜0.286ml、细胞悬浮液2ml，其中，山梨醇经过高压蒸汽灭菌，二甲基亚砜经过紫外灯灭菌；冷冻保护剂的体积可按上述比例扩大和缩小；D.降温冷冻程序：采用分步冷冻法：将预处理后的材料降温至4℃下静置预处理30min，再在‑20℃，停留30min，再‑40℃，静置3h，最后将处于冷冻保藏管中的细胞放置‑80℃中保存；E.冷冻保藏后的细胞复苏的培养步骤：(1)取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉；(2)将新鲜培养液置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭盛装培养液的容器，移入无菌操作台内；(3)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以70％酒精擦拭保藏管外部，移入无菌操作台内；(4)取出解冻的细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内，稀释比例为1∶10，混合均匀，放入培养箱培养；(5)在解冻培养后隔日更换培养液。