[发明专利]用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法

摘要

本发明公开了利用RNAi技术控制所述的水稻育性基因的表达获得水稻不育系的方法，包括扩增用于产生反义RNA的DNA片段，然后构建表达载体，再将该DNA片段转化正常可育水稻，可得新的水稻核不育材料。本发明提供的产生核不育系的方法简便，快速；利用本发明方法获得的核不育材料可用于在水稻杂交时取代人工去雄，节约劳力；或用于轮回选择育种，对扩大水稻的种质基础有重要作用。

主权项

利用RNAi技术控制如SEQ ID NO:1 所示序列的水稻育性基因的表达获得水稻不育系的方法，包括如下步骤：（1）以正常可育的水稻品种的cDNA为模板，以ASABCG15‑F和ASABCG15‑R为引物进行PCR扩增，获得493bp的PCR扩增产物，命名为ASABCG15；所述的引物为由SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的核苷酸序列；所述的PCR反应体系为：cDNA 3µL，dNTP 5µL，10XPCR 缓冲液 5µL，25mM Mg2+ 2µL，引物10µM 1.5µL；KOD‑plus‑NEO 酶 1.5µL；DMSO 1.5µL；H2O 30.5µL；所述的PCR的反应条件：94℃ 2min；98℃ 10s，68℃ 30s，35个循环；72℃10min，10℃ 1min；所述的ASABCG15由SEQ ID No:16所示的核苷酸序列组成；（2）回收PCR扩增产物，并将PCR扩增产物与载体PMD20连接，得连接产物；将连接产物转化至宿主细胞，37℃过夜培养；然后挑取单菌至LB液体培养基过夜培养；提取质粒，然后检测阳性质粒，并对质粒中的插入序列进行测序，确认插入序列为ASABCG15序列，得到PMD20‑ASABCG15载体；将PMD20‑ASABCG15载体和pOsAct2‑nos载体同时用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，将酶切产物回收，连接、转化，构建成pOsAct2‑ASABCG15载体；将pOsAct2‑ASABCG15 载体通过农杆菌转化到EHA105菌株，转化后所得菌株命名为EHA105‑pOsAct2‑ASABCG15；（3）培育水稻愈伤组织，将EHA105‑pOsAct2‑ASABCG15通过农杆菌介导转化的方法转化进水稻愈伤组织中，然后利用潮霉素基因对转基因苗进行阳性检测，并且对ABCG15的RNA表达量进行检测，选择表现完全雄性不育、且检测不到ABCG15表达量的植株，即为通过RNAi技术得到的水稻雄性核不育材料。