[发明专利]一种基于双向等温延伸的核酸合成方法

摘要

本发明涉及一种双向等温延伸的核酸拼接方法。该方法是设立一个延伸体系,延伸体系由一个起始双链,一组相互不同并能有序拼接的寡核苷酸,一个含有连接,聚合和限制性内切酶活性的混合酶,以及与混合酶配套的反应缓冲液组成；在多种酶的协作下,这些寡核苷酸以起始链为起始进行等温拼接,合成目标DNA长链。本发明具有成功率高、设计简单和操作简单、自动化高等特点,因而具有潜在的低成本优势,对于基因合成的推广,生物工程,生物医学和生物信息学等领域的发展存在潜在的应用价值。

主权项

1.一种基于双向等温延伸的核酸合成方法,包括以下步骤：设立一个延伸体系,延伸体系由一个起始双链,一组相互不同并能有序拼接的寡核苷酸,一个含有连接,聚合和限制性内切酶活性的混合酶,以及与混合酶配套的反应缓冲液组成；在多种酶的协作下,这些寡核苷酸以起始链为起始进行等温拼接,合成目标DNA长链；所述的寡核苷酸组中的每个寡核苷酸都是带有2‑10个碱基悬挂的发夹结构,发夹结构内部含有一个内切酶识别序列，寡核苷酸的5'端没有磷酸化；所述的拼接过程如下：连接酶将起始双链与体系中存在的某个发夹结构进行连接，聚合酶延伸使得发夹结构打开,限制性内切酶位点成为双链；限制性内切酶对已经成为双链的位点进行切割；然后延伸按下面3个步骤循环进行，直至合成目标DNA长链:(1)连接酶将切割产生的末端与体系中存在的某个发夹结构进行连接；(2)聚合酶延伸使得发夹结构打开,限制性内切酶位点成为双链；(3)限制性内切酶对已经成为双链的位点进行切割；其特征在于，所述起始双链是一个线性载体，是从目标序列的5'端和3'端向内延伸,最后在序列的中间发生连接,从而得到一个环化的DNA分子。