[发明专利]一种杨树遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种杨树遗传转化方法，包括从外植体选择、愈伤组织诱导、悬浮细胞系建立、悬浮细胞植株再生及培养基筛选、激素调配、抗生素敏感性、培养条件等方面建立杨树悬浮细胞系为受体的遗传转化技术系统，本发明以悬浮细胞系为受体农杆菌介导，通过建立生长迅速且细胞状态均一性好的悬浮细胞系，实现简便、快速的杨树遗传转化系统，为杨树转基因操作提供了一种新途径。

主权项

一种杨树遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取南林895杨幼嫩茎段和边缘有伤口的叶片，置于T培养基上诱导培养出愈伤组织；并经过T1培养基多次继代，筛选出状态良好的愈伤组织；其中，所述T培养基为MS+ 2,4‑D 2~3mg/L+蔗糖20g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；所述T1培养基为MS+2,4‑D 2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；（2）将筛选出的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养基为T2；其中，T2培养基为MS+2,4‑D2mg/L +NAA0.2mg/L+KT0.1mg/L+水解乳蛋白500mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min；（3）从平板中挑取含有待遗传转化目的基因的农杆菌单菌落，接种到附加卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、220rmp振荡培养24h，先做菌液PCR鉴定目的基因，再取已经PCR检测的阳性菌液1mL转接到50mL含相应抗生素的LB培养基中，培养12‑18h，5000rpm、4℃下离心10 min收集菌体，然后用液体MS培养基重悬菌体，用于侵染；（4）将步骤（2）的预培养后的悬浮细胞浸入步骤（3）的侵染菌液，振荡，浸泡后，除去多余菌液，放回愈伤组织芽诱导培养基M上进行共培养；其中，菌液浓度OD600为0.2‑1.0，侵染时间为2‑10min，共培养时间为1‑7d；（5）对共培养后的悬浮细胞洗涤除去农杆菌，转移到芽诱导筛选培养基M1上培养，直至分化出可见卡那霉素抗性芽；培养基M1为MS+6‑BA1.0mg/L +NAA 0.1mg/L +蔗糖30g/L +水晶洋菜1.8mg/L +kan20mg/L，pH5.8，121℃，灭菌16min；（6）将卡那霉素抗性芽连同外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基G继代培养；培养基G为MS+6‑BA0.2mg/L+TDZ 0.001mg/L+蔗糖30g/L+cef200mg/L+ kan20mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8，琼脂7.5g/ L，121℃，灭菌16min； （7）待卡那霉素抗性芽伸长至2～3cm后，移入生根筛选培养基G1；培养基G1为1/2MS+蔗糖25g/L+cef200mg/L+kan15mg/L，pH5.8，琼脂7.5g/L，121℃，灭菌16min。