[发明专利]制备高活性茶皂甙的生物转化方法

摘要

一种制备高活性茶皂甙的生物转化方法，属于生物化学工程技术领域。这种生物转化方法采用AB-8大孔树脂对粗茶皂甙的纯化、制备茶皂甙酶解底物、提取酶液、酶解茶皂甙和分离酶解组分的工艺过程，首次从米曲霉和黑曲霉菌株中提取到油茶皂甙水解酶，通过酶法水解油茶皂甙，实验条件温和、产物易于控制、降低污染排放，是一种绿色制造新工艺。且所得茶皂甙抗氧化活性较原油茶皂甙有很大提高。油茶饼中主要含有粗蛋白、糖类、油脂、茶皂甙等，具有很高的综合利用价值。因而，利用油茶饼提取茶皂甙，并对其进行酶解，进而得到低糖链高活性的茶皂甙，这对油茶饼综合利用的研究和开发应用将产生显著的经济效益和社会效益。

主权项

一种制备高活性茶皂甙的生物转化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用AB‑8大孔树脂对粗茶皂甙的纯化：将从油茶饼中提取到的粗茶皂甙用质量浓度为70～95%乙醇溶液浸泡，过滤得清液，50～75℃减压蒸出乙醇，得到油茶皂甙的清液，清液上AB‑8大孔树脂柱，静置使充分吸附，依次用去离子水、0.1%NaOH水溶液以1.5BV/h速度冲洗，再用去离子水洗至洗涤液pH＝7‑8，用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，50～75℃减压浓缩至干，获得纯化后茶皂甙；（2）茶皂甙酶解底物的制备：将纯化后的茶皂甙放入瓷碗中，加入甲醇使其溶解，且茶皂甙浓度为3‑8mg/mL，向该溶液中加入质量为茶皂甙质量5‑10倍的100～200目硅胶，搅拌均匀，置水浴锅上加热至65‑80℃，待溶剂挥发完全后制得样品胶；在层析柱中加入质量为茶皂甙质量30‑300倍的300～400目的硅胶，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶；硅胶柱装好后，先用纯氯仿通柱，再依次按体积比氯仿:甲醇=9:1、8:2、7:3、6:4、5:5梯度洗脱茶皂甙，分别收集洗脱液，并对收集到的产物进行分析，得到茶皂甙酶解底物－茶皂甙A5，其化学名称为3‑氧‑β‑D‑吡喃半乳糖基‑(1‑2)[β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1‑2)‑α‑L‑吡喃阿拉伯糖基(1‑3)]β‑D‑吡喃葡萄糖醛酸基‑21‑氧‑当归酸基‑28‑氧‑乙酰基‑茶皂甙元A；（3）酶液的提取：将豆粕搅碎，过20目筛，分别称取豆粕和麦麸，使二者的重量比为1：3，放入锥形瓶中，加入自来水使湿润，每g混合物加入1mL自来水，搅拌均匀，在121℃下灭菌15～20分钟，待冷却后，接入曲霉菌，于25～40℃下培养2～5天，待长出大量孢子后，向培养基中加入0.02mol/L、pH值为5.0的NaAc‑HAc缓冲液，缓冲液体积为前述自来水体积的5倍，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到酶液，在酶液中缓慢加入无水乙醇，使乙醇浓度为70%～75%，于2～8℃放置过夜，进行盐析，盐析后的酶液在8000‑10000转/分转速下离心10‑20分钟，将沉淀用1‑3mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中用醋酸缓冲液于2～8℃透析24‑48小时，之后再离心，所得上清液即为酶液；（4）茶皂甙的酶解：将相同体积的0.5～5.0mg/mL的步骤（2）得到的茶皂甙A5溶液和步骤（3）得到的酶液混和均匀，使pH值为4.0～6.0，40～55℃反应10～20小时，反应终止时，向反应体系中加 入2倍体积茶皂甙A5溶液的正丁醇摇晃多次，静置分层后，取出上层液，将正丁醇蒸干，即得酶解产物；（5）酶解组分的分离：采用1mm厚的硅胶制备层析板，按照薄层层析的方法和要求，分离步骤（4）得到的酶解产物，酶解产物用甲醇溶解成0.5～5.0mg/mL溶液进行点样，展开剂是：氯仿:甲醇:水=7:3:0.5，确定目标产物在层析板上的位置为Rf=0.67，用刀片刮下该位置的硅胶，再用1‑5mL甲醇将其溶解，过滤，将滤液浓缩后得到酶解后的皂甙产物A6，其化学名称为3‑氧‑[β‑D‑吡喃半乳糖基‑(1‑2)‑β‑D‑吡喃葡萄糖醛酸基]‑21‑氧‑当归酸基‑28‑氧‑乙酰基‑茶皂甙元A。